国家自然科学基金（授予孙晓彦82101249项），国家博士后科研工作基金（授予孙晓彦，批准号：2022M722125授予孙晓彦）。上海市帆船项目（授权号：21YF1425100）上海市卫生健康委员会临床研究专项（J 周 202340088 号拨款）.国家自然科学基金（第82101262项授予张旭，第82101287项授予陈旭）。

所有动物实验均按照《动物研究报告体内实验》（ARRIVE）指南和美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。本研究经上海交通大学医学院附属仁济医院动物护理与使用专业委员会批准。本研究采用8周龄C57BL/6J雄性小鼠。这些动物是商业获得的（见 材料表）并饲养在标准笼子中（22°C±2°C，12小时/ 12小时光照/黑暗循环，食物和水随意）。
1. 目标脑区域的选择
注意：这是一个无菌程序。确保所有手术器械都经过消毒。在接触手术器械之前，用酒精喷洒手套。避免戴手套触摸器械尖端或手术区域。在开始手术之前，通过检查矫正反射的丧失和对皮肤刺激没有反应，确保小鼠得到充分麻醉。在钻孔和注射之前，密切监测呼吸频率（每分钟60-220次呼吸，平均每分钟100-150次呼吸）和呼吸幅度（应保持一致，不要过浅或过深）。应注意呼吸频率或振幅的任何显着变化。
<ol><li>使用29G针头腹膜内注射1.25%三溴乙醇（250mg / kg）麻醉小鼠。一旦矫正反射消失，就剃掉头骨上的毛发。用鼻夹固定上门牙并使用两个耳杆稳定头部，将鼠标固定在立体定位框架中（参见 材料表）。</li>
	<li>使用眼药膏以防止眼睛干燥。用 Anerdian（消毒溶液;见 材料表）擦拭头皮三次对头皮进行消毒。使用 29 G 胰岛素针头皮下注射 0.2 mL 1% 利多卡因以提供局部镇痛。</li>
	<li>用眼剪刀做一个 0.5 厘米的切口，露出颅骨。使用蘸有 3% H2O2 的棉签擦洗暴露的颅骨以去除骨膜。让颅骨干燥。</li>
	<li>将钻头固定在立体定位仪器上。借助放大镜调整立体定位臂的旋钮，将钻尖精确定位在前囟上，并使用 LCD 数字显示屏记录 z 轴值。<ol><li>调整旋钮并将钻头放置在 lambda 上并记录 z 轴的值。调整鼻夹和耳杆，使两个 z 值更近，然后重复上述步骤，直到两个 z 值之间的差异小于 0.1 mm。 注意： LCD 数字显示屏上的 x、y 和 z 轴分别对应于内外侧 （ML）、前后 （AP） 和背腹 （DV）。一旦两个 z 值之间的差值小于 0.1 mm，就可以认为 bregma 和 lambda 位于同一水平面上。</li>
	</ol></li>
	<li>确保大脑的左右水平度。使用相同的刻度调整连接到立体定位框架的耳杆。以侧齿被盖腹侧部分（LDTgV）为例;根据 Paxinos 和富兰克林的小鼠大脑图谱16，它的立体定位坐标为 -5.2 表示 x，+0.8 表示 y，表示 z。<ol><li>调整耳杆，使钻头在（-5.2，+0.8）处测量背腹方向的z值，将钻头移动到（-5.2，-0.8）处测量z值。 注意： 当两个 z 值之间的差值小于 0.2 毫米时，左右被视为处于相等水平。耳杆需要插入正确的位置，因为外耳道是对称的。如果两个 z 值之间的差异超过 0.5 毫米，则耳杆可能插入了错误的位置。</li>
	</ol></li>
	<li>再次将钻头定位到前门，并在 LCD 数字显示屏上将三个坐标设置为零。使用参考坐标将钻头放置在感兴趣区域上方。开始演练。<ol><li>使用垂直臂逐渐降低钻头，直到它穿透颅骨。用棉签清除碎屑和血液。 注意：注意不要损伤脑组织。</li>
	</ol></li>
</ol>2.染料溶液的制备和脑显微注射
<ol><li>将 25 μL 含有溴酚蓝的 SDS-PAGE 上样缓冲液（参见 材料表）放入 200 μL 微量离心管中。向试管中加入 50 μL ddH2O 以制备染料溶液。</li>
	<li>用盐水湿的化妆棉盖住颅窗。通过反复抽吸和排出生理盐水来确保微注射器通畅。将 0.3 μL 染料加载到微量注射器中。将注射器和电动立体定位显微注射器连接到立体定位臂上。</li>
	<li>将注射器尖端放在前囟处，并在 LCD 数字显示屏上将坐标设置为零。根据参考坐标将针头调整到感兴趣的区域。将进样速度设置为 0.1 μL/min，然后启动电动显微注射器，将 0.3 μL 蓝色染料输送到目标区域。将注射器保持在原位至少 10 分钟，然后慢慢抽出注射器。 注意：在同一只小鼠中可以使用不同的颜色染料来区分紧密定位的区域。根据其他染料的物理特性测试其合适的浓度。建议使用溴酚蓝配方，并在使用前后彻底冲洗注射器，以防止堵塞。根据染料扩散调整进样体积。</li>
</ol>3. 脑组织采集和冷冻切片
<ol><li>将鼠标从立体定位帧中释放出来。使用29G针头腹膜内注射50mg / kg戊巴比妥钠麻醉小鼠。用胶带将鼠标固定在泡沫板上。</li>
	<li>打开胸部两侧以引起快速窒息。在右心耳上做一个 1-2 毫米的切口。将输液针插入左心室。输注 20 mL 预冷盐水和 20 mL 冰镇 4% 多聚甲醛溶液。</li>
	<li>用组织解剖剪刀斩首小鼠（遵循机构批准的方案）。从颈部到鼻子的中线切开一个切口，去除皮肤，然后露出头骨。用镊子或剪刀清除颅骨上的残留肌肉。</li>
	<li>将细剪刀的一根刀片的尖端放在枕骨大孔和大脑之间，锋利的边缘朝向骨头，位于矢状缝合线中部的喙端。继续沿着中矢状缝合线滑动并切割颅骨。用镊子切除头骨，露出暴露的大脑。 注意： 请注意，以免在手术过程中对大脑造成任何伤害。在取出骨屑之前，小心地剥去可能附着在颅骨上的任何脑膜。这种预防措施对于防止在此过程中无意中切开脑组织至关重要。</li>
	<li>打开旋转式切片机低温恒温器的电源（参见 材料表）并将腔室温度设置为 -20 °C。 倒入少许 OCT 化合物，均匀地覆盖标本盘的表面。将其放入冷冻室中，让 OCT 凝固。</li>
	<li>将圆盘连接到标本头上。将刀片靠近块，并修剪 OCT 块以形成平行于圆盘的平面。</li>
	<li>用剃须刀片在脑切片模具中，将大脑沿冠状方向切开，远离注射部位。将包含注射部位的脑组织，切口面朝下，放在 OCT 平面上。<ol><li>将 OCT 倒入大脑中，然后将圆盘放入冷冻室，让标本块凝固。将 OCT 反复倒入大脑，直到大脑完全嵌入 OCT。 注意：逐层添加 OCT 化合物。一旦前一层 OCT 被冻结，将下一层 OCT 化合物倒入大脑。</li>
	</ol></li>
	<li>修剪试样块，直到目标区域接近。从注射部位级别开始制作几个部分。使用保持在-20°C的小书写刷将冠状脑切片收集到含有室温PBS的6孔板中。 注意： 将切割厚度设置为更大的厚度以修剪块，然后在刀片接近注射部位时将切割厚度设置为 40 μm。如果使用神经回路示踪剂，则不会立即处死小鼠。将小鼠置于加热毯上的无菌术后恢复笼中，以便从麻醉中恢复。一旦醒来，将小鼠放回原来的笼子或新的笼子。</li>
</ol>4. 影像学检查
<ol><li>用室温PBS洗涤OCT。用刷子捡起大脑部分并将它们放在载玻片上。让切片在室温下风干。</li>
	<li>目视观察注射区域，当目标细胞核很小时，使用显微镜观察。将注射染料的位置与大脑图谱中的相应区域进行比较。 注意： 根据注射点偏差的方向和距离调整 x、y 和 z 轴的值。可能需要多次重复此协议中的所有步骤才能准确确定坐标。</li>
</ol>

优化小鼠立体定向显微注射的准确性

<ol>
	<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor-mediated+projection-specific+regulation+of+depressive-like+and+nociceptive+behaviors+in+the+mesolimbic+reward+circuitry.">Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry.</a> Pain. 159 (1), 175 (2018).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+pain+relief+pathways+originating+from+primary+motor+cortex.">Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex.</a> Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).</li><li>Laing, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+hypothalamic+parvalbumin+neurons+are+glutamatergic+and+promote+escape+behavior.">Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior.</a> Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).</li><li>Perens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+3D+mouse+brain+atlas+framework+with+the+skull-derived+coordinate+system.">Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system.</a> Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).</li><li>Adhikari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basomedial+amygdala+mediates+top-down+control+of+anxiety+and+fear.">Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear.</a> Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).</li><li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+infralimbic+cortex+to+paraventricular+thalamus+mediate+fear+extinction+retrieval.">Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval.</a> Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).</li><li>Ansarifar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+volume+and+expression+time+in+an+aav-delivered+channelrhodopsin.">Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin.</a> Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).</li><li>Gonzalez, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+AAV+capsid+evolution+strategies+for+enhanced+CNS+gene+delivery.">Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery.</a> Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).</li><li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+parallel+medial+prefrontal+cortex-amygdala+pathways+mediate+memory+deficits+via+glutamatergic+projection+in+surgery+mice.">Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice.</a> Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).</li><li>Koren, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insular+cortex+neurons+encode+and+retrieve+specific+immune+responses.">Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses.</a> Cell. 184 (25), 6211 (2021).</li><li>Poller, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+motor+and+fear+circuits+regulate+leukocytes+during+acute+stress.">Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress.</a> Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+circuit+related+to+habenula+underlies+the+antidepressive+effects+of+light+therapy.">A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy.</a> Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).</li><li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+circuit+related+to+the+periaqueductal+gray+area+for+the+antinociceptive+effects+of+bright+light+treatment.">A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment.</a> Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+stepwise+tracing+of+polysynaptic+neuronal+circuits+with+replication-deficient+pseudorabies+virus.">Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus.</a> Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).</li></ol>

提交人声明没有竞争利益。

本文描述了一种稳定的策略，可以在病毒追踪之前更快、更简单地验证立体定向脑注射的准确性 5,6，但报告基因在大脑区域表达的不可替代性对于大脑区域标记至关重要。我们使用的蓝色染料可以立即看到注射部位。
该协议中的几个关键步骤有助于提高注射部位的准确性。首先，从步骤1.5开始，确保大脑在立体定位仪中的左右水?...

几乎所有现代神经调控工具，包括体内钙记录、光遗传学和化学遗传学工具，都需要使用立体定位坐标来靶向感兴趣的大脑区域 1,2,3，从而形成神经操作的基础。小鼠大脑区域的立体定位坐标是相对于前囟和λ（颅骨上的骨标志）定义的，形成了所谓的颅骨衍生的立体定位坐标系统。bregma 或 lambda 都可以用作三维坐标的零点。这三个轴是前后轴 （AP）、内外侧轴 （ML） 和背腹轴 （DV），代表立体定位仪器数字显示屏上的 y、x 和 z 轴。对于众所周知的大脑区域，特定区域的立体定位坐标参数可以从小鼠脑图谱4（例如，Paxinos和Franklin的小鼠大脑在立体定位坐标中）和/或已发表的文献5,6中获得。然而，由于立体定位设备的变化和不同研究人员使用的小鼠的年龄/群体，需要进一步验证。
结构是功能的基础。神经回路构成了许多大脑功能的基础，例如认知活动、情绪、记忆、感觉和运动功能1.标记结构和操纵神经回路的活动对于理解特定神经回路的功能至关重要。在过去的几十年里，神经示踪剂已经进化了好几代;早期研究采用小麦胚芽凝集素（WGA）和菜豆凝集素（PHA）作为顺行示踪剂，氟金（FG）、霍乱毒素B亚基（CTB）、痰花青作为逆行示踪剂。然而，与病毒示踪剂不同，这些传统的神经示踪剂不能将外源基因整合到宿主中，也不具有细胞类型选择性。如今，病毒策略已成为基础神经科学研究中的一个重要命题。针对不同的研究目的，可以选择各种病毒工具7,8。有非跨突触病毒、反式多突触病毒（逆行和顺行）和跨单突触病毒（逆行和顺行）。每个类别都包含几种具有各自特征的类型。
病毒给药和表达的过程非常耗费时间和资源，通常需要数周甚至更长时间。在各种病毒载体中，腺相关病毒已被确定为一种有前途的基因递送手段，为实验程序提供了注射后 3 至 8 周的广泛窗口 7,8。随着 AAV 的发展，可以在给药后 2-3 周进行分析 9,10。其他神经回路示踪剂，如伪狂犬病病毒 （PRV） 和狂犬病病毒 （RV），也需要至少 2-7 天的追踪期 11,12,13,14,15。因此，在观察荧光信号之前对注射部位进行初步验证既省时又经济。
为了便于简单快速地验证立体定向注射，在这项研究中，在病毒载体之前施用染料，冷冻切片使研究人员能够在注射后 30 分钟内观察注射部位并对其进行追踪。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;L, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>65458-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-200-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Kindly group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3%H2O2 solution</td>
			<td>Lircon Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Shengyou Biotech</td>
			<td>20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anerdian</td>
			<td>Likang High-tech</td>
			<td>31001002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti roll plate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047742497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bend toothed dissecting forceps</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>JD1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellsens dimension software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi-Fluoromount-G</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Longxiang</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine brushes</td>
			<td>HWAHONG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>y00030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezing microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps straight with tooth</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>J31010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion needle 0.7 mm</td>
			<td>Kindly group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine hydrochloride injection</td>
			<td>Harvest Pharmaceutical Company</td>
			<td>71230803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male C57/BL mice</td>
			<td>The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research&#8211;BK Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice coronal brain slice mold</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-02-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Cisen Pharmaceutical Company</td>
			<td>G23HDM9M4S5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piette 2-200 &#956;L</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>4642080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaving blades</td>
			<td>BFYING</td>
			<td>91560618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Citotest Scientific</td>
			<td>188105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight toothed dissecting forceps</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Holder</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>J21040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>Aibei Biotechnology</td>
			<td>M2910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preliminary validation of stereotaxic injection coordinates via cryosectioning

特定大脑区域的立体定向注射构成了基础神经科学中的一项基本实验技术。研究人员通常根据小鼠脑图谱或已发表的材料来选择立体定位注射参数，这些材料采用了不同群体/年龄的小鼠和不同的立体定位设备，因此需要进一步验证立体定位坐标参数。钙成像、化学遗传学和光遗传学操作的功效依赖于感兴趣区域内报告基因的精确表达，通常需要数周的努力。因此，如果不事先验证目标大脑区域的坐标，这将是一项耗时的任务。使用适当的染料代替病毒并实施冷冻切片，研究人员可以在染料给药后立即观察注射部位。这有助于在实际注射位置和理论位置之间存在差异的情况下及时调整坐标参数。在随后的实验中，这种调整显著提高了靶区域内病毒表达的准确性。

Nearly all modern neuromodulation tools, including in vivo calcium recording, optogenetic, and chemogenetic tools, require the use of stereotaxic coordinates to target the brain area of interest1,2,3, forming the foundation of neural manipulation. Stereotaxic coordinates for mouse brain regions are defined in relation to bregma and lambda, the bony landmarks on the cranium, forming the so-called skull-derived stereotaxic coordinate system. Either bregma or lambda can serve as the zero point of the three-dimensional coordinates. The three axes are anteroposterior (AP), mediolateral (ML), and dorsoventral (DV), representing the y, x, and z axes on the digital display of stereotaxic instruments. For well-known brain regions, the stereotaxic coordinate parameters of a specific area can be obtained from mouse brain atlases4 (e.g., Paxinos and Franklin&#39;s mouse brain in stereotaxic coordinates) and/or the published literature5,6. However, further validation is necessary due to variations in stereotaxic equipment and the age/populations of mice used by different researchers.
Structure is the basis of function. Neural circuits form the foundation for many brain functions, such as cognitive activities, emotion, memory, sensory, and motor functions1. Labeling the structure and manipulating the activity of neural circuits are vital for understanding the function of a specific neural circuit. Over the past decades, neural tracers have evolved through many generations; early research adopted wheat germ agglutinin (WGA) and phaseolus vulgaris agglutinin (PHA) as anterograde tracers, and fluorogold (FG), cholera toxin subunit B (CTB), carbocyanine as retrograde tracers. However, unlike viral tracers, these traditional neural tracers cannot integrate exogenous genes into the host, nor do they have cell type selectivity. Nowadays, the viral strategy has become an important proposition during basic neuroscience research. For different research purposes, various viral tools can be selected7,8. There are non-transsynaptic viruses, trans-multisynaptic viruses (retrograde and anterograde), and trans-monosynaptic viruses (retrograde and anterograde). Each category contains several types with respective characteristics.
The process of viral administration and expression is highly time- and resource-intensive, often taking weeks or even longer. Among various viral vectors, adeno-associated virus has been identified as a promising means for gene delivery, providing a wide window ranging from 3 to 8 weeks post-injection for the experimental procedure7,8. As AAV evolves, analysis can be performed 2-3 weeks after administration9,10. Other neural circuit tracers, such as pseudorabies virus (PRV) and rabies virus (RV), also require a tracing period of at least 2-7 days11,12,13,14,15. Thus, a preliminary verification of the injection site before observing fluorescence signals is both time- and cost-effective.
To facilitate a simple and rapid verification of stereotaxic injections, in this study, a dye is administered before viral vectors, and cryosectioning enables researchers to observe the injection site and track it within 30 min post-injection.

作者聚焦：通过立体定向注射和经济高效的染料加速小鼠认知障碍研究

通过冷冻切片初步验证立体定向注射坐标

Our research primarily focus on investigating the neural circuits mechanism underlying cognitive impairment in mice. And we frequently employ brain stereotaxic techniques in these studies. Our objective is to optimize and accelerate the verification process for stereotaxic injection sites using dyes, ensuring that it becomes a simple and rapid procedure.Various strategies have become crucial in neuroscience research through stereotaxic injection of virus. This is followed by observation of fluorescent markers in tissue slice to confirm the injection sites, a process that takes several weeks to complete. Our protocol offers advantages over other techniques by saving at least three days of dehydration time and using a cost-effective dye for quicker identification of injection sites.It may save weeks compared with no preliminary verification.

该研究使用演示的方法在 30 分钟内成功确定了注射部位。最初，将含有溴酚蓝的SDS-PAGE样品上样溶液注射到C57 / BL小鼠的LDTgV中。 图1A 显示了染料溶液注入的示意图。蓝色染料在LDTgV中的分布如图 1B所示。
还将溴酚蓝注射到 mPFC 前边缘皮层、mPFC 边缘下皮层和基底杏仁核 （BMA） 中，以评估该方案的普遍性。如图1C-E</...

本方案描述了一种实用策略，用于在使用染料和冷冻切片进行病毒示踪之前加快立体定位注射坐标的验证步骤。

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...

我们的研究主要集中在研究小鼠认知障碍的神经回路机制。在这些研究中，我们经常采用大脑立体定位技术。我们的目标是优化和加速使用染料的立体定向注射位点的验证过程，确保它成为一个简单快速的过程。通过立体定向注射病毒，各种策略在神经科学研究中变得至关重要。接下来是观察组织切片中的荧光标记物以确认注射部位，这一过程需要数周时间才能完成。与其他技术相比，我们的方案具有优势，可节省至少三天的脱水时间，并使用具有成本效益的染料更快地识别注射部位。与没有初步验证相比，它可以节省数周时间。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

816 次观看.  Shanghai Jiaotong University, School of Medicine. 我们的研究主要集中在研究小鼠认知障碍的神经回路机制。在这些研究中，我们经常采用大脑立体定位技术。我们的目标是优化和加速使用染料的立体定向注射位点的验证过程，确保它成为一个简单快速的过程。通过立体定向注射病毒，各种策略在神经科学研究中变得至关重要。接下来是观察组织切片中的荧光标记物以确认注射部位，这一过程需要数周时间才能完成。?...

视频: 作者聚焦：通过立体定向注射和经济高效的染料加速小鼠认知障碍研究

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their choice of stereotaxic injection parameters on mouse brain atlases or published materials that employed various populations/ages of mice and different stereotaxic equipment, necessitating further validation of the stereotaxic coordinate parameters. The efficacy of calcium imaging, chemogenetic, and optogenetic manipulations relies on the precise expression of reporter genes within the region of interest, often requiring several weeks of effort. Thus, it is a time-consuming task if the coordinates of the target brain region are not verified in advance. Using an appropriate dye instead of a virus and implementing cryosectioning, researchers can observe the injection site immediately following dye administration. This facilitates timely adjustments to coordinate parameters in cases where discrepancies exist between the actual injection site and the theoretical position. Such adjustments significantly enhance the accuracy of viral expression within the target region in subsequent experiments.

The present protocol describes a practical strategy to expedite the verification step of stereotaxic injection coordinates before conducting viral tracing using dyes and frozen sections.