Name: preparation of raav9 to overexpress or knockdown genes in mouse hearts
Uploaded: 2016-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts at JoVE.com

We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).

<ol>
	<li>Primrose, S. B., Twyman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of gene manipulation and genomics. , (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li><li>Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -. O., Trono, D., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+tool+for+conditional+gene+expression+and+knockdown.">A versatile tool for conditional gene expression and knockdown.</a> Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).</li><li>Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Gene+Delivery+Systems.">Advances in Gene Delivery Systems.</a> BioMed Res. Int. 2015, 610342 (2015).</li><li>Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+delivery+systems.">Advances in gene delivery systems.</a> Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).</li><li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy.">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).</li><li>Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-mediated+gene+delivery+for+human+gene+therapy.">Virus-mediated gene delivery for human gene therapy.</a> J. Control Release. 161, 377-388 (2012).</li><li>Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+gene+therapy+approaches+for+osteosarcoma+using+viral+vectors:+review.">Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review.</a> Bone. 40, 797-812 (2007).</li><li>De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+c-Kit+signaling+pathway+in+mouse+primordial+germ+cells+by+retroviral-mediated+gene+transfer.">Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).</li><li>Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+delivery+into+male+germ+line+stem+cells.">Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells.</a> FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).</li><li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants.">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).</li><li>Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cell+cycle+status+on+early+events+in+retroviral+replication.">Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication.</a> J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).</li><li>Escors, D., Breckpot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+in+gene+therapy:+their+current+status+and+future+potential.">Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).</li><li>M&#225;trai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+lentiviral+vector+development+and+applications.">Recent advances in lentiviral vector development and applications.</a> Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).</li><li>Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+retroviral+genome+and+the+packaging.">Structural dynamics of retroviral genome and the packaging.</a> Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).</li><li>Douglas, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery.</a> Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques. , 3-14 (2004).</li><li>Armend&#225;riz-Borunda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+first+generation+adenoviral+vectors+for+preclinical+protocols:+amplification,+purification+and+functional+titration.">Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration.</a> J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).</li><li>Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery.">Adeno-associated virus-mediated gene delivery.</a> J Gene Med. 1, 166-175 (1999).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes.">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+transfer+in+porcine+myocardium+after+coronary+infusion+of+an+adeno-associated+virus+vector.">Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector.</a> Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).</li><li>Kaspar, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+gene+transfer+and+long-term+expression+following+intracoronary+delivery+of+adeno-associated+virus.">Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 7, 316-324 (2005).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trbp+regulates+heart+function+through+microRNA-mediated+Sox6+repression.">Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression.</a> Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac-specific+YAP+activation+improves+cardiac+function+and+survival+in+an+experimental+murine+MI+model.">Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model.</a> Circ. Res. 115, 354-363 (2014).</li><li>Wahlquist, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+miR-25+improves+cardiac+contractility+in+the+failing+heart.">Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart.</a> Nature. 508, 531-535 (2014).</li><li>Carroll, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adult+cardiac-specific+gene+deletion+with+CRISPR/Cas9.">A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).</li><li>Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+silencing+of+mutant+Myh6+transcripts+in+mice+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy.">Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy.</a> Science. 342, 111-114 (2013).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+annealing+temperature+for+DNA+amplification+in+vitro.">Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).</li><li>Allocca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype-dependent+packaging+of+large+genes+in+adeno-associated+viral+vectors+results+in+effective+gene+delivery+in+mice.">Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).</li><li>Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+trans-splicing+as+a+means+for+viral+vector-mediated+in+vivo+gene+therapy.">Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).</li><li>Piras, B. A., O'Connor, D. M., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+shRNA+by+AAV9+provides+highly+efficient+knockdown+of+ubiquitously+expressed+GFP+in+mouse+heart,+but+not+liver.">Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver.</a> PLoS One. 8, e75894 (2013).</li><li>Lovric, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+cardiac+and+skeletal+myocytes+induces+permissivity+to+AAV+transduction+by+relieving+inhibition+imposed+by+DNA+damage+response+proteins.">Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins.</a> Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ومن المهم للحد غير مرغوب فيها إعادة التركيب بالميدان خلال بناء البلازميد. قبل إنشاء الفيروس، يجب على المرء دائما مراقبة سلامة بالميدان من البلازميدات AAV باستخدام الهضم تقييد والاغاروز الكهربائي للهلام. فمن المستحيل الحصول على 100٪ البلازميدات سليمة، ولكن نسبة إعادة ...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/54787">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts</a>.
One of the authors names and affiliation was corrected from:
Jian-Ming Jiang3,4 
3 Department of Genetics, Harvard Medical School 
4 Howard Hughes Medical Institute
to:
Jianming Jiang5 
5 Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/54787">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts</a>.

Erratum: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

أصبحت السيطرة على التعبير أو نشاط جينات معينة في الأنظمة البيولوجية المختلفة استراتيجية قيمة في دراسة وظيفة الجين 1. وسيلة مباشرة لتحقيق هذا الهدف هو التلاعب تسلسل النوكليوتيدات وتوليد أليل متحولة. وعلى الرغم من اتخاذ دقيقة، والتغيرات التي تستهدف جينوم الخلايا الحية لا تزال ووممارسة كثيفة العمالة تستغرق وقتا طويلا، وقد فتحت تنمية قوية TALEN وكريسبر / Cas9 أدوات حقبة جديدة من تحرير الجينوم 2-5. وقد ركزت طريقة المخبرية الروتينية أكثر للتلاعب الجيني على إدخال المواد الجينية (السلطات الوطنية المعينة والرنا التي تحتوي على الترميز متواليات أو الرناوات siRNAs / shRNAs) إلى خلايا للتعبير أو ضربة قاضية الجين (ق) من الفائدة 1،6. في كثير من الحالات، وعقبة رئيسية للتلاعب الجيني هو تسليم DNA، RNA، أو البروتين في الخلايا. وفيما يتعلق الدراسات في المختبر، transfecti كفاءةعلى أنظمة أنشئت في كثير من خطوط الخلايا المستزرعة. ومع ذلك، في نموذج الفأر على وجه الخصوص، في الجسم الحي توصيل الجينات هو أكثر تحديا. وهناك سلسلة من الحواجز من خارج وداخل الخلايا التي تحتاج إلى تجاوزها من أجل تحقيق امتصاص الخلوية كفاءة من الكواشف الخارجية. وتشمل عقبات إضافية لإزالة السريع وقصر مدة المواد 7،8 تسليمها. استراتيجية واحدة للتحايل على هذه القضايا هي استخدام ناقلات فيروسية باسم &quot;ناقلات&quot; أو &quot;المركبات&quot; في الجسم الحي توصيل الجينات. خصائص التنبيغ تطورت بشكل طبيعي من الفيروسات تسمح التنفيذ الفعال لجينة من الفائدة إلى خلايا 7،9،10. وقد تم تطوير أنواع عديدة من النواقل الفيروسية وتمكين مرونة في التلاعب الجيني المجراة في أنواع مختلفة من الخلايا والأعضاء في الفئران. وتشمل أنظمة الفيروسية الأكثر شيوعا-الارتجاعي، الفيروسة البطيئة، اتش، والغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) <sتصل&gt; 11. الفيروسات هي الفيروسات RNA واحدة الذين تقطعت بهم السبل ويمكن إدخال المواد الجينية لجينوم الخلية المضيفة بطريقة مستقرة خلال تقسيم الإنقسامية، وتوفير إمكانات للتعبير مدى الحياة من الجينات transduced في الخلايا المستهدفة وأجهزة 12-14. ومع ذلك، وأنواع عديدة من الفيروسات تصيب فقط تقسيم الخلايا، ومدى فعاليتها في الخلايا غير تقسيم هو منخفض جدا 15. هذا يحد من فائدتها لتوصيل الجينات. الفيروسة البطيئة هو جنس من عائلة Retroviridae. مختلفة من الفيروسات الأخرى، ويمكن الفيروسة البطيئة تصيب كلا تقسيم الخلايا وعدم تقسيم واستخدمت على نطاق واسع لنقل الجين إلى ما بعد الإنقسامية وخلايا متباينة للغاية-16. دورة حياة الفيروسة البطيئة ينطوي أيضا على دمج الحمض النووي ناقلات في الجينوم المضيف. توصيل الجينات وبالتالي، الفيروسة البطيئة بوساطة تمكن مستقرة وطويلة الأجل التعبير عن العناصر الوراثية transduced 16-18. ومع ذلك، قد تمثل هذه الميزة الإلكترونية مزدوجالسيف جهاز &#39;في استخدام هذه الفيروسات لمعالجة التعبير الجيني، والتكامل من الحمض النووي ناقلات قد يؤدي إلى الطفرات إقحامي في الخلايا المضيفة ويمكن أن يسبب آثار مصطنع. اتش هو آخر يستخدم على نطاق واسع نظام توصيل الجينات. على عكس الفيروسات القهقرية وlentiviruses، الغدية هي غير متكامل ولا تتعارض مع سلامة الجينوم من الخلايا المضيفة 8،10،11،19. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الغدية transfect الحمض النووي في العديد من أنواع الخلايا، والإصابة ليست متوقفة على انقسام الخلايا النشطة 19. وهناك سمة أخرى مهمة من الغدية هو سهولة تنقية ناقلات، نظرا إلى أن ناقلات فيروسية القدرة على أن تتكرر 19،20. ومع ذلك، فإن التحذير الرئيسي لهذا النظام هو أن عدوى اتش يمكن أن تؤدي إلى استجابات مناعية قوية في الخلايا المستهدفة والأجهزة 19، وتقييد استخدامه في العديد من التحقيقات، لا سيما في الدراسات العلاج الجيني. مقارنة مع هذه نوع مختلفالصورة من النواقل الفيروسية، والفيروسات المرتبطة الغدة-المؤتلف (rAAV) ويبدو أن نظام توصيل الجينات المثالي 21،22. فإنه يسلك الحد الأدنى المناعية والمرضية 23،24. وبالإضافة إلى ذلك، rAAV يصيب مجموعة واسعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الفاصل والخلايا غير الانقسام. في معظم الحالات، لا rAAV ليس الاندماج في الجينوم المضيف؛ وبالتالي، فإن مخاطر التغيرات الوراثية أو الجينوم غير مرغوب فيها في الخلايا المستهدفة منخفض 22. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت أنظمة rAAV بنجاح لفي الجسم الحي تسليم البروتينات ترميز الحمض النووي، miRNAs، shRNAs، وكريسبر-gRNAs في الماوس عضلة القلب 23،25-29. وقد سهلت هذه المنهجية التحقيقات الأساسية والدراسات العلاج الجيني في مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية. هنا، وإجراءات مفصلة لتوليد ناقلات rAAV9 أن بإفراط بكفاءة أو ضربة قاضية لجينات الفائدة في قلوب الماوس وصفه. وينص البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لالتلاعب التعبير الجيني القلب في الفئران نماذج تجريبية.

<table><tbody><tr><td>Polyethylenimine, Linear (MW 25,000)</td><td>Polysciences, Inc.&amp;nbsp;</td><td>#23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Polypropylene, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (qty. 56)</td><td>Beckman Coulter, Inc</td><td># 362183</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease, ultrapure</td><td>SIGMA</td><td>#E8263-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Density Gradient Medium(Iodixanol)</td><td>SIGMA</td><td>#D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>#UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory pipetting needle with 90&amp;deg; blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub</td><td>SIGMA</td><td>#CAD7942-12EA</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188 solution (Pluronic&amp;reg; F-68 solution)</td><td>SIGMA</td><td>P5556-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>SIGMA</td><td>3115828001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge machine</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge System</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biologicals&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>rAAV9 vector</td><td>Penn Vector Core</td><td>P1967</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of raav9 to overexpress or knockdown genes in mouse hearts

السيطرة على التعبير أو نشاط جينات معينة من خلال تقديم عضلة القلب من المواد الجينية في نماذج الفئران يسمح التحقيق في وظائف الجينات. الإمكانات العلاجية في قلب كما يمكن تحديدها. هناك أساليب محدودة في الجسم الحي تدخل الجزيئي في قلب فأر. وقد استخدمت المؤتلف فيروس الغدة المرتبطة (rAAV) هندسة الجينوم المستندة كأداة أساسية في الجسم الحي التلاعب الجيني القلب. وتشمل المزايا المحددة لهذه التكنولوجيا عالية الكفاءة، والدقة العالية، وانخفاض معدل التكامل الجيني، الحد الأدنى المناعية، والحد الأدنى المرضية. هنا، يتم وصف إجراءات تفصيلية لبناء، حزمة، وتنقية ناقلات rAAV9. حقن تحت الجلد rAAV9 إلى الجراء حديثي الولادة النتائج في التعبير القوي أو ضربة قاضية كفاءة من هذا الجين (ق) من الفائدة في قلب فأر، ولكن ليس في الكبد والأنسجة الأخرى. باستخدام القلب-specifiتم الحصول ج TnnT2 المروج والتعبير عالية من الجين GFP في القلب. بالإضافة إلى ذلك، استهداف وتثبيط مرنا في القلب عندما كان يستخدم لrAAV9-U6-shRNA. العمل معرفة التكنولوجيا rAAV9 قد يكون من المفيد إجراء تحقيقات القلب والأوعية الدموية.

وترد الاستراتيجيات لبناء rAAV9 من rAAV9.cTNT :: GFP أو البلازميدات rAAV9.U6 :: shRNA في أرقام 1 و 2 على التوالي. كما الأمثلة، تم إنشاء ناقلات rAAV9 إلى بإفراط عن الجين GFP في قلوب الماوس. يحتوي البلازميد ينتج عن ذلك من cTNT :: الكاسيت GFP يحيط بها اثنان بالميد?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts at JoVE.com

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

إعداد rAAV9 إلى بإفراط أو ضربة قاضية الجينات في قلوب ماوس

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

preparation-of-raav9-to-overexpress-or-knockdown-genes-in-mouse-hearts

Research

JoVE Journal

Genetics

12.7K Views.  Boston Children's Hospital. In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described. 

Video: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising treatment option for heart disease, owing to its efficiency and exceptional therapeutic effects. In an effort to repair the damaged tissue post-MI, various studies have employed DNA-based or viral gene therapy but have faced considerable hurdles due to the poor and uncontrolled expression of the delivered genes, edema, arrhythmia, and cardiac hypertrophy. Synthetic modified mRNA (modRNA) presents a novel gene therapy approach that offers high, transient, safe, nonimmunogenic, and controlled mRNA delivery to the heart tissue without any risk of genomic integration. Due to these remarkable characteristics combined with its bell-shaped pharmacokinetics in the heart, modRNA has become an attractive approach for the treatment of heart disease. However, to increase its effectiveness in vivo, a consistent and reliable delivery method needs to be followed. Hence, to maximize modRNA delivery efficiency and yield consistency in modRNA use for in vivo applications, an optimized method of preparation and delivery of modRNA intracardiac injection in a mouse MI model is presented. This protocol will make modRNA delivery more accessible for basic and translational research.

This protocol presents a simple and coherent way to transiently upregulate a gene of interest using modRNA after myocardial infarction in mice.

تسليم مرنا معدلة في نموذج الماوس احتشاء مايدق

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

العزلة والتلاعب الجيني لأمراض القلب للبالغين Myocytes التصوير متحد البؤر

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Biology

التحوير القائم على التثقيب الكهربائي لخلايا القلب في قلوب الفئران

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

تسليط الضوء على المؤلف: تحويل خلايا القلب لفحص الجينات السريع

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

نهج فعال للجينات المعدلة لتوصيل الجينات في القلب الجنيني للفأر

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Developmental Biology

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

مرتبطة بالغدة التسليم الفيروس بوساطة من كريسبر للجينات القلب التحرير في الفئران

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Medicine

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

وسم الخلية وحقن في تطوير الجنينية الماوس قلوب

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), fibroblasts can be reprogrammed into induced cardiomyocytes (iCMs). These iCMs, when generated in situ in an infarcted heart, integrate electrically and mechanically with the surrounding myocardium, leading to a reduction in scar size and an improvement in heart function. Because of the relatively low reprogramming efficiency, purity, and quality of the iCMs, characterization of iCMs remains a challenge. The currently used methods in this field, including flow cytometry, immunocytochemistry, and qPCR, mainly focus on cardiac-specific gene and protein expression but not on the functional maturation of iCMs. Triggered by action potentials, the opening of voltage-gated calcium channels in cardiomyocytes leads to a rapid influx of calcium into the cell. Therefore, quantifying the rate of calcium influx is a promising method to evaluate cardiomyocyte function. Here, the protocol introduces a method to evaluate iCM function by calcium (Ca2+) flux. An &#945;MHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mouse strain was established by crossing Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (referred to as Myh6-Cre below) with Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referred to as Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 below) mice. Neonatal cardiac fibroblasts (NCFs) from P0-P2 neonatal mice were isolated and cultured in vitro, and a polycistronic construction of MGT was introduced to NCFs, which led to their reprogramming to iCMs. Because only successfully reprogrammed iCMs will express GCaMP3 reporter, the functional maturation of iCMs can be visually assessed by Ca2+ flux with fluorescence microscopy. Compared with un-reprogrammed NCFs, NCF-iCMs showed significant calcium transient flux and spontaneous contraction, similar to CMs. This protocol describes in detail the mouse strain establishment, isolation and selection of neonatal mice hearts, NCF isolation, production of retrovirus for cardiac reprogramming, iCM induction, the evaluation of iCM Ca2+ flux using our reporter line, and related statistical analysis and data presentation. It is expected that the methods described here will provide a valuable platform to assess the functional maturation of iCMs for cardiac reprogramming studies.

We describe here, the establishment and application of an Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referred to as &#945;MHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 below) mouse reporter line for cardiac reprogramming assessment. Neonatal cardiac fibroblasts (NCFs) isolated from the mouse strain are converted into induced cardiomyocytes (iCMs), allowing for convenient and efficient evaluation of reprogramming efficiency and functional maturation of iCMs via calcium (Ca2+) flux.

في المختبر تقييم إعادة برمجة القلب عن طريق قياس تدفق الكالسيوم القلب محددة مع مراسل GCaMP3

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

إسكات الجينات الانتقائي في الضفيرة المشيمية

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and pathological conditions. Recent research has shown that regulating ChP activity may offer protection against CNS disorders. However, studying the biological function of the ChP without affecting other brain regions is challenging due to its delicate structure. This study presents a novel method for gene knockdown in ChP tissue using adeno-associated viruses (AAVs) or cyclization recombination enzyme (Cre) recombinase protein consisting of TAT sequence (CRE-TAT). The results demonstrate that after injecting AAV or CRE-TAT into the lateral ventricle, the fluorescence was exclusively concentrated in the ChP. Using this approach, the study successfully knocked down the adenosine A2A receptor (A2AR) in the ChP using RNA interference (RNAi) or Cre/locus of X-overP1 (Cre/LoxP) systems, and showed that this knockdown could alleviate the pathology of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This technique may have important implications for future research on the ChP's role in CNS disorders.

تسليط الضوء على المؤلف: رؤى وابتكارات في تقنيات معالجة التعبير الجيني لأبحاث الضفيرة المشيمية 

Here, we describe a method to selectively alter gene expressions in the choroid plexus while avoiding any impact in other brain areas.

ضربة قاضية مستهدفة للجينات في الضفيرة المشيمية

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

إعداد rAAV9 إلى بإفراط أو ضربة قاضية الجينات في قلوب ماوس

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تسليم مرنا معدلة في نموذج الماوس احتشاء مايدق

العزلة والتلاعب الجيني لأمراض القلب للبالغين Myocytes التصوير متحد البؤر

نهج فعال للجينات المعدلة لتوصيل الجينات في القلب الجنيني للفأر

نهج فعال للجينات المعدلة لتوصيل الجينات في القلب الجنيني للفأر

نهج فعال للجينات المعدلة لتوصيل الجينات في القلب الجنيني للفأر

مرتبطة بالغدة التسليم الفيروس بوساطة من كريسبر للجينات القلب التحرير في الفئران

وسم الخلية وحقن في تطوير الجنينية الماوس قلوب

في المختبر تقييم إعادة برمجة القلب عن طريق قياس تدفق الكالسيوم القلب محددة مع مراسل GCaMP3

ضربة قاضية مستهدفة للجينات في الضفيرة المشيمية

ضربة قاضية مستهدفة للجينات في الضفيرة المشيمية