اجتذبت الإكسوسومات المشتقة من الأنسجة اهتماما متزايدا نظرا لقدرتها على عكس خصوصية الأنسجة والبيئة الدقيقة بدقة. ركز بحثنا على معرفة الأدوار الأساسية والانتقالية للإكسوسومات المشتقة من الطحال في أمراض القلب والأوعية الدموية. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول عملي لعزل الإكسوسومات من أنسجة طحال الفئران ، مما يوفر تقنية قابلة للتكرار لتحليل التعريف اللاحق والدراسات الوظيفية.
نستخدم الكولاجيناز من النوع الأول للهضم ، متبوعا بالترشيح من خلال الطرد المركزي التفاضلي لإنتاج إكسوسوم الطحال عالي الجودة. على عكس التقارير السابقة ، باستخدام تجانس الأنسجة للحصول على تعليق الأنسجة ، يحافظ نهجنا على سلامة غشاء الخلايا في الأنسجة. يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة بشكل خاص في دراسة دور الإكسوسوم في الاستجابات المناعية.
بالنظر إلى الوظيفة الحرجة للطحال في الجهاز المناعي ، يمكن للدراسات المستقبلية تكييف هذا البروتوكول مع الأنسجة البشرية ، مما يتيح استخراج الإكسوسوم ذي الصلة سريريا للأغراض التشخيصية والعلاجية. للبدء ، قم بتبريد أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة وفائقة السرعة مسبقا إلى أربع درجات مئوية واضبط درجة حرارة شاكر سطح المكتب على 37 درجة مئوية. تحضير أطباق زراعة الخلايا التي يبلغ قطرها 100 ملم.
بعد ذلك ، قم بترتيب 50 مل من أنابيب الطرد المركزي المعقمة والثلج ومصافي الخلايا المعقمة بقطر 70 ميكرومتر. رش 75٪ كحول لتعقيم المقص والملقط وتسخينها على درجة حرارة عالية لتعقيمها أكثر. بعد ذلك ، ضع أنسجة الطحال في طبق بتري معقم 100 ملم على الثلج واغسل الدم السطحي ب 1X PBS البارد.
جفف الطحال جيدا بشاش معقم قبل وزن الأنسجة. بعد ذلك ، باستخدام ماصة نقل معقمة ، أضف ملليلترا واحدا من PBS إلى مصفاة خلية 70 ميكرومتر لترطيبها. أخيرا ، قم بإعداد 0.1٪ كولاجيناز من النوع الأول في 1X PBS باستخدام خلاط دوامة للحصول على المخزن المؤقت للهضم.
للبدء ، قم بإعداد الكواشف والأدوات المعقمة لمعالجة الأنسجة. باستخدام المقص ، قم بتقطيع أنسجة الطحال إلى قطع صغيرة موحدة في طبق استزراع على الجليد وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر باستخدام ماصة نقل معقمة. بعد ذلك ، أضف عازلة الهضم إلى الأنبوب بناء على وزن أنسجة الطحال ، وقم بهز الأنبوب بزاوية 45 درجة على شاكر أفقي مضبوطة على 37 درجة مئوية.
أوقف عملية الهضم عندما تتشتت قطع الأنسجة وتفقد معظم القطع شكلها. انقل الخليط المهضوم من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في درجة حرارة الغرفة لإزالة بقايا الأنسجة الليفية والكبيرة. اجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل.
قم بالطرد المركزي للمرشح عند 500 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وكرر خطوة الطرد المركزي بسرعات مناسبة. بعد الطرد المركزي الفائق ، تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات باستخدام PBS.
جهاز طرد مركزي فائق مرة أخرى عند 120،000 جم لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية لعزل الإكسوسومات. أخيرا ، قم بإذابة الإكسوسومات المعزولة في 200 ميكرولتر من PBS المعقم لكل طحال وتخزينها في أنبوب طرد مركزي سعة ملليلترين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. كشفت صور المجهر الإلكتروني للإرسال عن وجود حويصلات على شكل كوب مع طبقة ثنائية دهنية ، مميزة للإكسوسومات.
تراوحت أحجام الإكسوسوم من 30 إلى 150 نانومتر مع ذروة تركيز عند 60 نانومتر كما هو موضح في الرسم البياني لتوزيع الحجم. أكد تحليل اللطخة الغربية وجود علامات خارجية ، TSG101 و CD9 ، بينما لم يتم الكشف عن GM130 والتحكم السلبي.
