Gewebeabgeleitete Exosomen haben aufgrund ihrer Fähigkeit, die Gewebespezifität und die Mikroumgebung genau widerzuspiegeln, zunehmend Aufmerksamkeit erregt. Unsere Forschung konzentrierte sich auf die Erforschung der grundlegenden und translationalen Rolle von Milz-abgeleiteten Exosomen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen. In dieser Studie entwickeln wir ein praktisches Protokoll zur Isolierung von Exosomen aus Milzgewebe von Mäusen, das eine reproduzierbare Technik für nachfolgende Identifizierungsanalysen und funktionelle Studien bietet.
Wir verwenden eine Typ-I-Kollagenase für den Aufschluss, gefolgt von der Filtration durch differentielle Ultrazentrifugation, um ein hochwertiges Milz-Exosom zu erhalten. Im Gegensatz zu früheren Berichten bewahrt unser Ansatz bei der Verwendung von Gewebehomogenisierung zur Gewinnung einer Gewebesuspension die Membranintegrität von Zellen im Gewebe. Diese Technik könnte besonders nützlich sein, um die Rolle des Exosoms bei der Immunantwort zu untersuchen.
Angesichts der kritischen Funktion der Milz im Immunsystem könnten zukünftige Studien dieses Protokoll an menschliches Gewebe anpassen und so die Extraktion klinisch relevanter Exosomen für diagnostische und therapeutische Zwecke ermöglichen. Kühlen Sie zunächst die Hochgeschwindigkeits- und Ultrahochgeschwindigkeitszentrifugen auf vier Grad Celsius vor und stellen Sie die Temperatur des Tischschüttlers auf 37 Grad Celsius ein. Bereiten Sie die Zellkulturschalen mit einem Durchmesser von 100 Millimetern vor.
Ordnen Sie dann 50 Milliliter sterile Zentrifugenröhrchen, Eis und sterile Zellsiebe mit einem Durchmesser von 70 Mikrometern an. Sprühen Sie 75% Alkohol, um die Schere und Pinzette zu sterilisieren, und erhitzen Sie sie auf eine hohe Temperatur, um sie weiter zu sterilisieren. Legen Sie dann das Milzgewebe in eine sterile 100 Millimeter Petrischale auf Eis und waschen Sie das Oberflächenblut mit kaltem 1X PBS ab.
Trocknen Sie die Milz gründlich mit steriler Gaze ab, bevor Sie das Gewebe wiegen. Geben Sie anschließend mit einer sterilen Transferpipette einen Milliliter PBS in ein 70-Mikrometer-Zellsieb, um es zu befeuchten. Bereiten Sie schließlich 0,1 % Typ-I-Kollagenase in 1X PBS mit einem Vortex-Mischer vor, um den Aufschlusspuffer zu erhalten.
Bereiten Sie zunächst die Reagenzien und die sterilen Werkzeuge für die Gewebeverarbeitung vor. Schneiden Sie das Milzgewebe mit einer Schere in einer Kulturschale auf Eis in kleine, gleichmäßige Stücke und geben Sie diese mit einer sterilen Transferpipette in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie dann den Verdauungspuffer basierend auf dem Gewicht des Milzgewebes in das Röhrchen und schütteln Sie das Röhrchen in einem 45-Grad-Winkel auf einem horizontalen Shaker, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist.
Stoppen Sie die Verdauung, wenn sich die Gewebebrocken zerstreut haben und die meisten Stücke ihre Form verloren haben. Übertragen Sie die verdaute Mischung bei Raumtemperatur durch ein 70-Mikrometer-Zellensieb, um faserige und größere Gewebereste zu entfernen. Sammeln Sie das Filtrat in einem neuen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 500 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt bei geeigneter Geschwindigkeit. Nach der Ultrazentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet mit PBS waschen.
Ultrazentrifugieren Sie erneut bei 120.000 G für zwei Stunden bei vier Grad Celsius, um die Exosomen zu isolieren. Zum Schluss lösen Sie die isolierten Exosomen in 200 Mikrolitern sterilem PBS pro Milz auf und lagern sie in einem zwei Milliliter Zentrifugenröhrchen bei minus 80 Grad Celsius. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten das Vorhandensein von becherförmigen Vesikeln mit einer Lipiddoppelschicht, die für Exosomen charakteristisch ist.
Die Exosomengrößen reichten von 30 bis 150 Nanometern, wobei die Spitzenkonzentration bei 60 Nanometern lag, wie das Größenverteilungsdiagramm zeigt. Die Western-Blot-Analyse bestätigte das Vorhandensein der exosomalen Marker TSG101 und CD9, während GM130 und die Negativkontrolle nicht nachgewiesen wurden.
