Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues(생쥐 비장 조직에서 유래한 엑소좀의 분리 및 특성 분석)

조직 유래 엑소좀은 조직 특이성과 미세환경을 정확하게 반영할 수 있는 능력으로 인해 점점 더 주목받고 있습니다. 우리의 연구는 심혈관 질환에서 비장 유래 엑소좀의 기본 및 번역 역할을 파악하는 데 중점을 두었습니다. 이 연구에서는 생쥐 비장 조직에서 엑소좀을 분리하기 위한 실용적인 프로토콜을 개발하여 후속 식별 분석 및 기능 연구를 위한 재현 가능한 기술을 제공합니다.

우리는 소화를 위해 Type I 콜라겐분해효소를 사용한 다음 차등 초원심분리를 통해 여과하여 고품질 비장 엑소좀을 생성합니다. 이전 보고와 대조적으로, 조직 균질화를 사용하여 조직 현탁액을 얻는 당사의 접근 방식은 조직 내 세포의 막 무결성을 보존합니다. 이 기술은 면역 반응에서 엑소좀의 역할을 연구하는 데 특히 유용할 수 있습니다.

면역 체계에서 비장의 중요한 기능을 감안할 때, 향후 연구에서는 이 프로토콜을 인체 조직에 적용하여 진단 및 치료 목적으로 임상적으로 관련된 엑소좀을 추출할 수 있습니다. 먼저 고속 및 초고속 원심분리기를 섭씨 4도로 사전 냉각하고 데스크탑 셰이커의 온도를 섭씨 37도로 설정합니다. 직경이 100mm인 세포 배양 접시를 준비합니다.

그런 다음 직경 70마이크로미터의 멸균 원심분리기 튜브 50mL, 얼음 및 멸균 세포 여과기를 배열합니다. 75% 알코올을 분사하여 가위와 집게를 살균하고 고온에서 가열하여 추가 살균합니다. 그런 다음 비장 조직을 얼음 위의 멸균된 100mm 페트리 접시에 넣고 차가운 1X PBS로 표면 혈액을 씻어냅니다.

조직의 무게를 측정하기 전에 멸균 거즈로 비장을 완전히 건조시킵니다. 다음으로, 멸균 전사 피펫을 사용하여 70마이크로미터 세포 여과기에 PBS 1mL를 첨가하여 적십니다. 마지막으로 와류 믹서로 1X PBS에서 0.1 % I 형 콜라겐 분해 효소를 준비하여 분해 완충액을 얻습니다.

시작하려면 조직 처리를 위한 시약과 멸균 도구를 준비합니다. 가위를 사용하여 비장 조직을 얼음 위의 배양 접시에 넣고 작고 균일한 조각으로 자르고 멸균 전사 피펫을 사용하여 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 비장 조직의 무게에 따라 소화 완충액을 튜브에 추가하고 섭씨 37도로 설정된 수평 셰이커에서 튜브를 45도 각도로 흔듭니다.

조직 덩어리가 흩어지고 대부분의 조각이 모양을 잃었을 때 소화를 중지하십시오. 분해된 혼합물을 실온에서 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 이송하여 섬유질 및 더 큰 조직 파편을 제거합니다. 새로운 50밀리리터 원심분리기 튜브에 여과액을 수집합니다.

여과액을 500G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 새 튜브로 옮기고 적절한 속도로 원심분리 단계를 반복합니다. 초원심분리 후, 상층액을 버리고 PBS로 펠릿을 세척합니다.

초원심분리기는 다시 120, 000 G에서 섭씨 4도에서 2시간 동안 엑소좀을 분리합니다. 마지막으로 분리된 엑소좀을 비장당 200마이크로리터의 멸균 PBS에 용해시키고 섭씨 영하 80도의 2밀리리터 원심분리기에 보관합니다. 투과 전자 현미경 이미지를 통해 엑소좀의 특징인 지질 이중층이 있는 컵 모양의 소포가 있는 것으로 나타났습니다.

엑소좀의 크기는 30나노미터에서 150나노미터 사이였으며 크기 분포 그래프에서 볼 수 있듯이 최대 농도는 60나노미터였습니다. 웨스턴 블롯 분석 결과 엑소좀 마커인 TSG101 및 CD9의 존재가 확인되었으나 GM130 및 음성 대조군은 검출되지 않았습니다.