Los exosomas derivados de tejidos han atraído cada vez más atención debido a su capacidad para reflejar con precisión la especificidad de los tejidos y el microambiente. Nuestra investigación se centró en descubrir las funciones básicas y traslacionales de los exosomas derivados del bazo en las enfermedades cardiovasculares. En este estudio, desarrollamos un protocolo práctico para aislar exosomas de tejidos de bazo de ratones, proporcionando una técnica reproducible para el posterior análisis de identificación y estudios funcionales.
Utilizamos una colagenasa de tipo I para la digestión, seguida de filtración a través de ultracentrifugación diferencial para producir un exosoma de bazo de alta calidad. A diferencia de los informes anteriores, utilizando la homogeneización de tejidos para obtener la suspensión de tejidos, nuestro enfoque preserva la integridad de la membrana de las células en los tejidos. Esta técnica podría ser particularmente útil para estudiar el papel del exosoma en las respuestas inmunitarias.
Dada la función crítica del bazo en el sistema inmune, estudios futuros podrían adaptar este protocolo a tejidos humanos, permitiendo la extracción de exosomas clínicamente relevantes con fines diagnósticos y terapéuticos. Para comenzar, enfríe previamente las centrífugas de alta y ultra alta velocidad a cuatro grados centígrados y ajuste la temperatura del agitador de escritorio a 37 grados centígrados. Prepare las placas de cultivo celular, que tengan un diámetro de 100 milímetros.
Luego, coloque tubos de centrífuga estériles de 50 mililitros, hielo y filtros de células estériles con un diámetro de 70 micrómetros. Rocíe alcohol al 75% para esterilizar las tijeras y pinzas y caliéntelas a alta temperatura para esterilizar aún más. Luego, coloque el tejido del bazo en una placa de Petri estéril de 100 milímetros sobre hielo y lave la sangre de la superficie con PBS frío 1X.
Seque bien el bazo con una gasa estéril antes de pesar los pañuelos. A continuación, con una pipeta de transferencia estéril, añada un mililitro de PBS a un colador de células de 70 micrómetros para humedecerlo. Por último, prepare la colagenasa tipo I al 0,1% en 1X PBS con un mezclador de vórtice para obtener el tampón de digestión.
Para empezar, prepare los reactivos y las herramientas estériles para el procesamiento de tejidos. Con unas tijeras, corte el tejido del bazo en trozos pequeños y uniformes en una placa de cultivo con hielo y transfiéralos a un tubo de centrífuga de 50 mililitros utilizando una pipeta de transferencia estéril. Luego, agregue el tampón de digestión al tubo en función del peso del tejido del bazo y agite el tubo en un ángulo de 45 grados en un agitador horizontal ajustado a 37 grados Celsius.
Detenga la digestión cuando los trozos de tejido se hayan dispersado y la mayoría de los trozos hayan perdido su forma. Transfiera la mezcla digerida a través de un colador de células de 70 micrómetros a temperatura ambiente para eliminar los desechos de tejido fibroso y más grandes. Recoja el filtrado en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Centrifugar el filtrado a 500 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y repita el paso de centrifugación a las velocidades adecuadas. Después de la ultracentrifugación, deseche el sobrenadante y lave el pellet con PBS.
Ultracentrífuga de nuevo a 120.000 G durante dos horas a cuatro grados centígrados para aislar los exosomas. Finalmente, disuelva los exosomas aislados en 200 microlitros de PBS estéril por bazo y guárdelos en un tubo de centrífuga de dos mililitros a menos 80 grados Celsius. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión revelaron la presencia de vesículas en forma de copa con una bicapa lipídica, característica de los exosomas.
Los tamaños de los exosomas oscilaron entre 30 y 150 nanómetros, con una concentración máxima de 60 nanómetros, como se muestra en el gráfico de distribución de tamaños. El análisis de Western blot confirmó la presencia de marcadores exosomales, TSG101 y CD9, mientras que no se detectó GM130 ni control negativo.
