Экзосомы, полученные из тканей, привлекают все большее внимание благодаря своей способности точно отражать тканевую специфичность и микроокружение. Наше исследование было сосредоточено на выяснении основной и трансляционной роли экзосом, полученных из селезенки, при сердечно-сосудистых заболеваниях. В этом исследовании мы разрабатываем практический протокол выделения экзосом из тканей селезенки мышей, обеспечивая воспроизводимую технику для последующего анализа идентификации и функциональных исследований.
Мы используем коллагеназу I типа для пищеварения с последующей фильтрацией с помощью дифференциального ультрацентрифугирования для получения высококачественной экзосомы селезенки. В отличие от предыдущих исследований, использующих гомогенизацию тканей для получения тканевой суспензии, наш подход сохраняет мембранную целостность клеток в тканях. Этот метод может быть особенно полезен при изучении роли экзосом в иммунных реакциях.
Учитывая критическую функцию селезенки в иммунной системе, будущие исследования могут адаптировать этот протокол к тканям человека, что позволит извлекать клинически значимые экзосомы для диагностических и терапевтических целей. Для начала предварительно охладите высокоскоростные и сверхскоростные центрифуги до четырех градусов Цельсия и установите температуру настольного шейкера на 37 градусов Цельсия. Готовят для клеточных культур посуду, имеющие диаметр 100 миллиметров.
Затем расставьте стерильные центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров, лед и стерильные клеточные фильтры диаметром 70 микрометров. Распылите 75% спирт для стерилизации ножниц и щипцов и нагрейте их при высокой температуре для дальнейшей стерилизации. Затем поместите ткань селезенки в стерильную 100-миллиметровую чашку Петри на льду и смойте поверхностную кровь холодом 1X PBS.
Тщательно высушите селезенку стерильной марлей перед взвешиванием тканей. Далее с помощью стерильной переводной пипетки добавьте один миллилитр PBS в клеточное ситечко толщиной 70 микрометров, чтобы увлажнить его. Наконец, приготовьте 0,1%-ную коллагеназу типа I в 1X PBS с помощью вихревого смесителя для получения буфера для пищеварения.
Для начала подготовьте реактивы и стерильные инструменты для обработки тканей. С помощью ножниц измельчите ткань селезенки на мелкие однородные кусочки в чашке для культуры на льду и перенесите их в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров с помощью стерильной трансферной пипетки. Затем добавьте буфер для пищеварения в трубку в зависимости от веса ткани селезенки и встряхните трубку под углом 45 градусов на горизонтальном шейкере, установленном на 37 градусов по Цельсию.
Остановите пищеварение, когда куски ткани разошлись и большинство кусочков потеряли свою форму. Пропустите переваренную смесь через клеточное сетчатое фильтр с температурой 70 микрометров при комнатной температуре, чтобы удалить волокнистые и более крупные остатки тканей. Соберите фильтрат в новую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров.
Центрифугируйте фильтрат при 500 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и повторите этап центрифугирования с соответствующими скоростями. После ультрацентрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу PBS.
Снова ультрацентрифугуйте при 120 000 G в течение двух часов при четырех градусах Цельсия, чтобы изолировать экзосомы. Наконец, растворите выделенные экзосомы в 200 микролитрах стерильного PBS на селезенку и храните их в двухмиллилитровой центрифужной пробирке при температуре минус 80 градусов Цельсия. Изображения с помощью просвечивающей электронной микроскопии выявили наличие чашеобразных везикул с липидным бислоем, характерных для экзосом.
Размеры экзосом варьировались от 30 до 150 нанометров с пиковой концентрацией на уровне 60 нанометров, как показано на графике распределения по размерам. Вестерн-блоттинг подтвердил наличие экзосомальных маркеров, TSG101 и CD9, в то время как GM130 и негативный контроль не были обнаружены.
