אקסוזומים שמקורם ברקמה משכו תשומת לב גוברת בשל יכולתם לשקף במדויק את ספציפיות הרקמה ואת המיקרו-סביבה. המחקר שלנו התמקד בהבנת התפקידים הבסיסיים והתרגומיים של אקסוזומים שמקורם בטחול במחלות לב וכלי דם. במחקר זה, אנו מפתחים פרוטוקול מעשי לבידוד אקסוזומים מרקמות הטחול של עכברים, ומספק טכניקה הניתנת לשחזור עבור ניתוח זיהוי עוקב ומחקרים פונקציונליים.
אנו משתמשים בקולגנאז מסוג I לעיכול, ולאחר מכן סינון באמצעות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי להניב אקסוזום טחול באיכות גבוהה. בניגוד לדיווחים קודמים, באמצעות הומוגניזציה של רקמות להשגת תרחיף רקמות, הגישה שלנו שומרת על שלמות הממברנה של תאים ברקמות. שיטה זו יכולה להיות שימושית במיוחד בחקר התפקיד של אקסוזום בתגובות חיסוניות.
בהתחשב בתפקוד הקריטי של הטחול במערכת החיסון, מחקרים עתידיים יוכלו להתאים פרוטוקול זה לרקמות אנושיות, ולאפשר מיצוי של אקסוזום רלוונטי מבחינה קלינית למטרות אבחון וטיפול. כדי להתחיל, קררו מראש את הצנטריפוגות המהירות והאולטרה-מהירות לארבע מעלות צלזיוס וכוונו את הטמפרטורה של השייקר השולחני ל-37 מעלות צלזיוס. הכינו את מנות תרבית התא, בקוטר של 100 מ"מ.
לאחר מכן, סדרו צינורות צנטריפוגות סטריליות, קרח ומסננות תאים סטריליים בקוטר של 70 מיקרומטר. רססו 75% אלכוהול כדי לעקר את המספריים והמלקחיים וחממו אותם בטמפרטורה גבוהה כדי לעקר אותם עוד יותר. לאחר מכן, הניחו את רקמת הטחול בצלחת פטרי סטרילית של 100 מ"מ על קרח ושטפו את הדם על פני השטח עם PBS קר 1X.
יבש היטב את הטחול עם גזה סטרילית לפני שקילת הרקמות. לאחר מכן, באמצעות פיפטה העברה סטרילית, להוסיף מיליליטר אחד של PBS למסננת תאים 70 מיקרומטר כדי להרטיב אותו. לבסוף, להכין 0.1% סוג I collagenase ב 1X PBS עם מערבל מערבולת כדי לקבל את מאגר העיכול.
כדי להתחיל, להכין את הריאגנטים ואת הכלים סטריליים לעיבוד רקמות. בעזרת מספריים קוצצים את רקמת הטחול לחתיכות קטנות ואחידות בצלחת תרבית על קרח ומעבירים אותן לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר באמצעות פיפטה סטרילית. לאחר מכן, הוסף את חיץ העיכול לצינור בהתבסס על משקל רקמת הטחול, ונער את הצינור בזווית של 45 מעלות על שייקר אופקי שנקבע ל -37 מעלות צלזיוס.
עצור את העיכול כאשר גושי הרקמה התפזרו ורוב החתיכות איבדו את צורתן. העבירו את התערובת המעוכלת דרך מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר בטמפרטורת החדר כדי להסיר פסולת רקמה סיבית וגדולה יותר. אספו את התסנין בצינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר.
צנטריפוגה את התסנין ב 500 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את הסופרנאטנט לצינור חדש וחזרו על שלב הצנטריפוגה במהירויות המתאימות. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה עם PBS.
אולטרה-צנטריפוגה שוב ב 120, 000 G במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס כדי לבודד את האקסוזומים. לבסוף, המסו את האקסוזומים המבודדים ב-200 מיקרוליטר PBS סטרילי לטחול ואחסנו אותם בצינור צנטריפוגה של שני מיליליטר בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור חשפו נוכחות של שלפוחיות בצורת גביע עם דו-שכבה שומנית, האופיינית לאקסוזומים.
גדלי האקזוזום נעו בין 30 ל -150 ננומטר עם ריכוז שיא של 60 ננומטר כפי שמוצג בגרף התפלגות הגודל. ניתוח כתמים מערביים אישר את נוכחותם של סמנים אקסוזומליים, TSG101 ו- CD9, בעוד GM130 ובקרה שלילית לא זוהו.
