Os exossomos derivados de tecidos têm atraído atenção crescente devido à sua capacidade de refletir com precisão a especificidade do tecido e o microambiente. Nossa pesquisa se concentrou em descobrir os papéis básicos e translacionais dos exossomos derivados do baço nas doenças cardiovasculares. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo prático para isolar exossomos de tecidos do baço de camundongos, fornecendo uma técnica reprodutível para posterior análise de identificação e estudos funcionais.
Usamos uma colagenase Tipo I para digestão, seguida de filtração por ultracentrifugação diferencial para produzir exossomo de baço de alta qualidade. Em contraste com relatos anteriores, usando homogeneização tecidual para obter suspensão tecidual, nossa abordagem preserva a integridade da membrana das células nos tecidos. Essa técnica pode ser particularmente útil no estudo do papel do exossomo nas respostas imunes.
Dada a função crítica do baço no sistema imunológico, estudos futuros poderiam adaptar este protocolo aos tecidos humanos, permitindo a extração de exossomos clinicamente relevantes para fins diagnósticos e terapêuticos. Para começar, pré-resfrie as centrífugas de alta e ultra-alta velocidade a quatro graus Celsius e ajuste a temperatura do agitador de mesa para 37 graus Celsius. Prepare as placas de cultura de células, com um diâmetro de 100 milímetros.
Em seguida, organize tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros, gelo e filtros de células estéreis com um diâmetro de 70 micrômetros. Pulverize 75% de álcool para esterilizar as tesouras e pinças e aqueça-as em alta temperatura para esterilizar ainda mais. Em seguida, coloque o tecido do baço em uma placa de Petri estéril de 100 milímetros no gelo e lave o sangue da superfície com PBS 1X frio.
Seque bem o baço com gaze estéril antes de pesar os tecidos. Em seguida, usando uma pipeta de transferência estéril, adicione um mililitro de PBS a um filtro de células de 70 micrômetros para umedecê-lo. Finalmente, prepare colagenase 0,1% tipo I em 1X PBS com um misturador de vórtice para obter o tampão de digestão.
Para começar, prepare os reagentes e as ferramentas estéreis para o processamento de tecidos. Com uma tesoura, pique o tecido do baço em pedaços pequenos e uniformes em uma placa de cultura no gelo e transfira-os para um tubo de centrífuga de 50 mililitros usando uma pipeta de transferência estéril. Em seguida, adicione o tampão de digestão ao tubo com base no peso do tecido do baço e agite o tubo em um ângulo de 45 graus em um agitador horizontal ajustado para 37 graus Celsius.
Pare a digestão quando os pedaços de tecido se dispersarem e a maioria dos pedaços perder a forma. Transfira a mistura digerida através de um filtro de células de 70 micrômetros em temperatura ambiente para remover detritos de tecido fibroso e maior. Recolher o filtrado num novo tubo de centrifugação de 50 ml.
Centrifugar o filtrado a 500 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo e repetir a etapa de centrifugação a velocidades adequadas. Após a ultracentrifugação, rejeitar o sobrenadante e lavar o pellet com PBS.
Ultracentrifugar novamente a 120 000 G durante duas horas a quatro graus Celsius para isolar os exossomas. Finalmente, dissolva os exossomos isolados em 200 microlitros de PBS estéril por baço e armazene-os em um tubo de centrífuga de dois mililitros a menos 80 graus Celsius. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão revelaram a presença de vesículas em forma de taça com bicamada lipídica, característica dos exossomos.
Os tamanhos dos exossomos variaram de 30 a 150 nanômetros com concentração máxima de 60 nanômetros, conforme mostrado pelo gráfico de distribuição de tamanho. A análise de Western blot confirmou a presença de marcadores exossômicos, TSG101 e CD9, enquanto GM130 e controle negativo não foram detectados.
