Meu grupo está interessado nos mecanismos que regulam a expressão gênica em células progenitoras neurais do neocórtex em desenvolvimento. E, particularmente, nos concentramos nos mecanismos epigenéticos. Estes são importantes para o potencial de proliferação e diferenciação das células progenitoras neurais e, portanto, para o desenvolvimento e função adequados do cérebro.
Os organoides corticais são novos modelos empolgantes que nos permitem estudar o desenvolvimento do cérebro humano. Eles também nos permitem modelar o desenvolvimento de outras espécies de primatas. Neste protocolo, descrevemos a eletroporação de organoides corticais humanos para estudar a função gênica.
Os organoides são cortados com um vibratome, o que os torna particularmente acessíveis para injeção e eletroporação. A eletroporação de organoides corticais humanos representa uma técnica poderosa para estudar a função dos genes. Usamos o método para estudar o fator de crescimento expresso de primatas EPIREGULIN, que está implicado no desenvolvimento e evolução do cérebro.
Também usamos o método para estudar a atividade de regiões potenciadoras de diferentes espécies de primatas. Para começar, incorpore os organoides corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em agarose de baixo ponto de fusão a 3%. Corte os organoides em um vibratomo em seções de 500 micrômetros de espessura.
Após o corte, continue cultivando organoides em uma placa de fixação ultrabaixa de seis poços contendo quatro meio cerebral três em um agitador orbital a 120 rpm. Em seguida, defina o extrator microcapilar para as configurações especificadas para puxar os capilares de vidro borossilicato para injeções. Após puxar, guarde os capilares em uma placa de Petri grande e prenda-os com fita adesiva.
No dia da eletroporação, pré-aqueça a solução de Tyrode a 37 graus Celsius e prepare o CRISPR Cas9 RNP a uma concentração final de 24 micromolares. Adicione o plasmídeo pCAG-GFP e a solução 0,1% Fast Green em água à mistura final de injeção. Selecione os organoides corticais humanos com estruturas semelhantes a ventrículos bem desenvolvidas e descarte os organoides que não possuem essas estruturas.
Transfira até 10 organoides para uma placa de Petri de 6 centímetros contendo a solução de Tyrode. Usando uma ponta de pipeta microcarregadeira, encha um microcapilar de vidro com 10 microlitros da solução de injeção. Abra o capilar beliscando a ponta fina com uma pinça.
Verifique se o capilar está aberto liberando um pouco da mistura de injeção na solução de Tyrode. Insira o capilar no centro das estruturas semelhantes a ventrículos e pressione o pedal de um microinjetor para injetar 0,2-0,5 microlitros da mistura. Use uma pinça fina para empurrar o organoide para restringir seu movimento sem agarrá-lo.
Após a injeção, usando uma ponta de pipeta de diâmetro largo, transfira um para dois organoides injetados em uma câmara de eletroporação contendo a solução de Tyrode. Oriente os organoides injetados em direção aos eletrodos, garantindo que a glia radial apical e as regiões semelhantes a ventrículos estejam voltadas para fora. Conecte os cabos à câmara de eletroporação com o lado injetado do organoide voltado para o pólo positivo.
Pressione o botão Pulse no eletroporador para fornecer cinco pulsos de 38 volts por 50 milissegundos cada em intervalos de 1 segundo. Após a eletroporação, retorne os organoides corticais humanos aos quatro cérebros médios três e cultive-os sem agitar por 24 horas. Após a fixação e crioseccionamento de organoides corticais humanos eletroporados, realizar a recuperação do antígeno em tampão citrato por uma hora a 70 graus Celsius em banho-maria para análise imuno-histoquímica.
Lave as seções uma vez em PBS por cinco minutos. Em seguida, seque as lâminas brevemente e use uma caneta de cera para circular as seções. Resfrie as seções usando glicina molar 0,1 em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, lave as seções duas vezes com PBS por cinco minutos cada. Adicione tampão de bloqueio nas seções e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, incube a seção em anticorpos primários durante a noite a 4 graus Celsius.
No dia seguinte, lave as seções três vezes com PBS por cinco minutos cada. Incubar as seções com anticorpos secundários e DAPI em um tampão de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente. Depois de lavar a seção com PBS, monte a lâmina com meio de montagem e faça a imagem das seções usando um microscópio fluorescente.
A imuno-histoquímica de organoides eletroporados revelou múltiplos ventrículos-alvo dentro de um organoide cortical eletroporado com eletroporações ideais direcionadas a estruturas semelhantes a ventrículos localizadas nas regiões externas do organoide. A solução de problemas é necessária se for observada morte celular excessiva. Isso pode ser causado por altas concentrações de plasmídeo ou configurações de eletroporação abaixo do ideal.
As eletroporações voltadas para o interior do organoide são frequentemente mais difíceis de interpretar devido às áreas semelhantes a placas corticais que se fundem com os ventrículos adjacentes. A ruptura da superfície apical pode ocorrer quando um volume excessivo de injeção ou fortes pulsos elétricos são aplicados, levando a rupturas de ventrículos e delaminação celular. O nocaute da proteína PCGF4 do complexo repressivo 1 de Polycomb foi confirmado por imuno-histoquímica, mostrando redução da intensidade de sinal em células GFP positivas.
A análise da intensidade do sinal de células positivas para GFP revelou uma redução significativa nos níveis de proteína PCGF4 em amostras nocaute em comparação com os controles.
