Meine Gruppe interessiert sich für die Mechanismen, die die Genexpression in neuralen Vorläuferzellen des sich entwickelnden Neokortex regulieren. Und insbesondere konzentrieren wir uns auf epigenetische Mechanismen. Diese sind wichtig für das Potenzial der neuralen Vorläuferzellen, sich zu vermehren und zu differenzieren, und damit für die ordnungsgemäße Entwicklung und Funktion des Gehirns.
Kortikale Organoide sind aufregende neue Modelle, die es uns ermöglichen, die Entwicklung des menschlichen Gehirns zu untersuchen. Sie ermöglichen es uns auch, die Entwicklung anderer Primatenarten zu modellieren. In diesem Protokoll beschreiben wir die Elektroporation von menschlichen kortikalen Organoiden, um die Genfunktion zu untersuchen.
Die Organoide werden mit einem Vibratom in Scheiben geschnitten, was sie besonders für die Injektion und Elektroporation zugänglich macht. Die Elektroporation von menschlichen kortikalen Organoiden stellt eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der Genfunktion dar. Wir haben die Methode verwendet, um den Wachstumsfaktor EPIREGULIN von Primaten zu untersuchen, der an der Entwicklung und Evolution des Gehirns beteiligt ist.
Wir haben die Methode auch verwendet, um die Aktivität von Enhancer-Regionen verschiedener Primatenarten zu untersuchen. Betten Sie zunächst die menschlichen kortikalen Organoide, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden, in Agarose mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 3 % ein. Schneiden Sie die Organoide auf einem Vibratom in 500 Mikrometer dicke Abschnitte.
Kultivieren Sie die Organoide nach dem Schneiden weiter in einer Sechs-Well-Platte mit ultraniedrigem Attachment mit vier Gehirn-Medium-drei auf einem Orbitalschüttler bei 120 U/min. Stellen Sie als Nächstes den Mikrokapillarabzieher auf die angegebenen Einstellungen ein, um die Borosilikatglaskapillaren für Injektionen zu ziehen. Bewahren Sie die Kapillaren nach dem Ziehen in einer großen Petrischale auf und sichern Sie sie mit Klebeband.
Am Tag der Elektroporation wird die Lösung von Tyrode auf 37 Grad Celsius vorgewärmt und das CRISPR Cas9 RNP auf eine Endkonzentration von 24 Mikromolaren vorbereitet. Geben Sie das pCAG-GFP-Plasmid und die 0,1%ige Fast Green-Lösung in Wasser in die endgültige Injektionsmischung. Wählen Sie die menschlichen kortikalen Organoide mit gut entwickelten ventrikelähnlichen Strukturen aus und verwerfen Sie die Organoide, denen diese Strukturen fehlen.
Übertragen Sie bis zu 10 Organoide in eine 6 Zentimeter große Petrischale, die die Tyrode-Lösung enthält. Füllen Sie mit einer Microloader-Pipettenspitze eine Mikrokapillare aus Glas mit 10 Mikrolitern der Injektionslösung. Öffne die Kapillare, indem du das dünne Ende mit einer Pinzette abkneifst.
Prüfen Sie, ob die Kapillare offen ist, indem Sie einen Teil der Injektionsmischung in die Tyrode-Lösung abgeben. Führen Sie die Kapillare in die Mitte der ventrikelartigen Strukturen ein und drücken Sie den Fußschalter eines Mikroinjektors, um 0,2-0,5 Mikroliter der Mischung zu injizieren. Schiebe das Organoid mit einer feinen Pinzette so an, dass es seine Bewegung einschränkt, ohne es zu greifen.
Nach der Injektion werden mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung ein bis zwei injizierte Organoide in eine Elektroporationskammer mit Tyrode-Lösung übertragen. Richten Sie die injizierten Organoide in Richtung der Elektroden aus, wobei Sie darauf achten, dass die apikalen radialen Gliazellen und ventrikelähnlichen Regionen nach außen zeigen. Befestigen Sie die Kabel an der Elektroporationskammer, wobei die injizierte Seite des Organoids zum Pluspol zeigt.
Drücken Sie die Pulse-Taste am Elektroporator, um fünf Impulse mit 38 Volt für jeweils 50 Millisekunden im Abstand von 1 Sekunde abzugeben. Nach der Elektroporation werden die menschlichen kortikalen Organoide wieder in das Vier-Gehirn-Medium drei zurückgeführt und 24 Stunden lang ohne Schütteln kultiviert. Nach der Fixierung und Kryosektion von elektroporierten humanen kortikalen Organoiden ist eine Stunde lang eine Antigengewinnung in Citratpuffer bei 70 Grad Celsius in einem Wasserbad zur immunhistochemischen Analyse durchzuführen.
Waschen Sie die Abschnitte einmal fünf Minuten lang in PBS. Trocknen Sie dann die Dias kurz ab und kreisen Sie die Abschnitte mit einem Wachsstift ein. Die Schnitte werden mit 0,1 molaren Glycin in PBS 30 Minuten lang bei Raumtemperatur abgeschreckt.
Waschen Sie dann die Abschnitte zweimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS. Geben Sie Blockierungspuffer auf die Schnitte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Dann inkubieren Sie den Abschnitt in Primärantikörpern über Nacht bei 4 Grad Celsius.
Waschen Sie die Abschnitte am nächsten Tag dreimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS. Inkubieren Sie die Schnitte mit Sekundärantikörpern und DAPI in einem Blockierungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen des Schnittes mit PBS den Objektträger mit Eindeckmedium montieren und die Schnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop abbilden.
Die Immunhistochemie von elektroporierten Organoiden zeigte mehrere zielgerichtete Ventrikel innerhalb eines elektroporierten kortikalen Organoids mit optimalen Elektroporationen, die auf ventrikelähnliche Strukturen abzielten, die sich in den äußeren Regionen des Organoids befinden. Eine Fehlerbehebung ist erforderlich, wenn ein übermäßiger Zelltod beobachtet wird. Dies kann durch hohe Plasmidkonzentrationen oder suboptimale Elektroporationseinstellungen verursacht werden.
Elektroporationen, die dem Inneren des Organoids zugewandt sind, sind oft schwieriger zu interpretieren, da kortikale plattenartige Bereiche mit benachbarten Ventrikeln verschmelzen. Eine Störung der apikalen Oberfläche kann auftreten, wenn ein übermäßiges Injektionsvolumen oder starke elektrische Impulse angelegt werden, was zu Ventrikelrupturen und Zelldelamination führt. Der Knockout des Polycomb-repressiven Komplex-1-Proteins PCGF4 wurde immunhistochemisch bestätigt und zeigte eine verminderte Signalintensität in GFP-positiven Zellen.
Die Signalintensitätsanalyse von GFP-positiven Zellen zeigte eine signifikante Verringerung der PCGF4-Proteinspiegel in Knockout-Proben im Vergleich zu Kontrollproben.
