Grubum, gelişmekte olan neokorteksin nöral progenitör hücrelerinde gen ekspresyonunu düzenleyen mekanizmalarla ilgileniyor. Ve özellikle, epigenetik mekanizmalara odaklanıyoruz. Bunlar, nöral progenitör hücrelerin çoğalma ve farklılaşma potansiyeli ve dolayısıyla uygun beyin gelişimi ve işlevi için önemlidir.
Kortikal organoidler, insan beyninin gelişimini incelememize izin veren heyecan verici yeni modellerdir. Ayrıca diğer primat türlerinin gelişimini modellememize de izin veriyorlar. Bu protokolde, gen fonksiyonunu incelemek için insan kortikal organoidlerinin elektroporasyonunu açıklıyoruz.
Organoidler bir vibratom ile dilimlenir, bu da onları enjeksiyon ve elektroporasyon için özellikle erişilebilir kılar. İnsan kortikal organoidlerinin elektroporasyonu, gen fonksiyonunu incelemek için güçlü bir tekniği temsil eder. Bu yöntemi, beyin gelişimi ve evriminde rol oynayan primat ekspres büyüme faktörü EPIREGULIN'i incelemek için kullandık.
Bu yöntemi, farklı primat türlerinden gelen geliştirici bölgelerin aktivitesini incelemek için de kullandık. Başlamak için, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen insan kortikal organoidlerini %3 düşük erime noktalı agaroza gömün. Organoidleri bir vibratom üzerinde 500 mikrometre kalınlığında bölümler halinde dilimleyin.
Dilimlemeden sonra, organoidleri 120 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde dört beyin ortamı üç içeren altı kuyulu ultra düşük bir bağlantı plakasında kültürlemeye devam edin. Ardından, enjeksiyonlar için borosilikat cam kılcal damarları çekmek için mikrokılcal çektirmeyi belirtilen ayarlara ayarlayın. Çektikten sonra, kılcal damarları büyük bir Petri kabında saklayın ve bantla sabitleyin.
Elektroporasyon gününde, Tyrode'un çözeltisini 37 santigrat dereceye ısıtın ve CRISPR Cas9 RNP'yi 24 mikromolar nihai konsantrasyonda hazırlayın. Son enjeksiyon karışımına suya pCAG-GFP plazmidi ve %0.1 Hızlı Yeşil çözelti ekleyin. İyi gelişmiş ventrikül benzeri yapılara sahip insan kortikal organoidlerini seçin ve bu yapılardan yoksun olan organoidleri atın.
Tyrode çözeltisini içeren 6 santimetrelik bir Petri kabına 10'a kadar organoid aktarın. Bir mikro yükleyici pipet ucu kullanarak, bir cam mikro kılcal damarı 10 mikrolitre enjeksiyon solüsyonu ile doldurun. İnce ucunu cımbızla sıkıştırarak kılcal damarı açın.
Enjeksiyon karışımının bir kısmını Tyrode çözeltisine bırakarak kılcal damarın açık olup olmadığını kontrol edin. Kılcal damarı ventrikül benzeri yapıların merkezine yerleştirin ve karışımın 0.2-0.5 mikrolitresini enjekte etmek için bir mikroenjektörün ayak pedalına basın. Organoidi tutmadan hareketini kısıtlamak için itmek için ince forseps kullanın.
Enjeksiyondan sonra, geniş delikli bir pipet ucu kullanarak, enjekte edilen bir ila iki organoidi Tyrode solüsyonu içeren bir elektroporasyon odasına aktarın. Enjekte edilen organoidleri elektrotlara doğru yönlendirin, apikal radyal glia ve ventrikül benzeri bölgelerin dışa bakmasını sağlayın. Kabloları, organoidin enjekte edilen tarafı pozitif kutba bakacak şekilde elektroporasyon odasına takın.
38 saniye aralıklarla her biri 50 milisaniye boyunca 1 voltluk beş darbe vermek için elektroporatör üzerindeki Darbe düğmesine basın. Elektroporasyondan sonra, insan kortikal organoidlerini dört beyin ortamı üçe geri getirin ve 24 saat boyunca sallamadan kültürleyin. Elektroporasyonlu insan kortikal organoidlerinin fiksasyonu ve kriyoseksiyonundan sonra, immünohistokimyasal analiz için bir su banyosunda 70 santigrat derecede bir saat boyunca sitrat tamponunda antijen alımı gerçekleştirin.
Bölümleri PBS'de bir kez beş dakika yıkayın. Ardından slaytları kısa bir süre kurulayın ve bölümleri daire içine almak için bir balmumu kalemi kullanın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS'de 0.1 molar glisin kullanarak bölümleri söndürün.
Daha sonra bölümleri PBS ile iki kez beş dakika yıkayın. Bölümlere bloke edici tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, bölümü gece boyunca 4 santigrat derecede primer antikorlarda inkübe edin.
Ertesi gün, bölümleri PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Bölümleri ikincil antikorlar ve DAPI ile oda sıcaklığında bir saat boyunca bir bloke edici tamponda inkübe edin. Bölümü PBS ile yıkadıktan sonra, sürgüyü montaj ortamıyla monte edin ve bölümleri bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin.
Elektroporasyonlu organoidlerin immünohistokimyası, organoidin dış bölgelerinde yer alan ventrikül benzeri yapıları hedef alan optimal elektroporasyonlara sahip elektroporasyonlu kortikal bir organoid içinde çok sayıda hedeflenmiş ventrikül ortaya çıkardı. Aşırı hücre ölümü gözlenirse sorun giderme gereklidir. Bu, yüksek plazmit konsantrasyonlarından veya yetersiz elektroporasyon ayarlarından kaynaklanabilir.
Organoidin iç kısmına bakan elektroporasyonların, bitişik ventriküllerle birleşen kortikal plaka benzeri alanlar nedeniyle yorumlanması genellikle daha zordur. Aşırı enjeksiyon hacmi veya güçlü elektrik darbeleri uygulandığında apikal yüzeyin bozulması meydana gelebilir, bu da ventrikül yırtılmalarına ve hücre delaminasyonuna yol açabilir. Polycomb baskılayıcı kompleks 1 proteini PCGF4'ün nakavt, GFP pozitif hücrelerde azalmış sinyal yoğunluğunu gösteren immünohistokimya ile doğrulandı.
GFP pozitif hücrelerin sinyal yoğunluğu analizi, nakavt numunelerinde kontrollere kıyasla PCGF4 protein seviyelerinde önemli bir azalma olduğunu ortaya koydu.
