우리 그룹은 발달 중인 신피질의 신경전구세포에서 유전자 발현을 조절하는 메커니즘에 관심이 있습니다. 특히 후성유전학적 메커니즘에 초점을 맞춥니다. 이는 신경전구세포의 증식 및 분화 가능성, 따라서 적절한 뇌 발달 및 기능에 중요합니다.
피질 오가노이드는 인간 뇌의 발달을 연구할 수 있는 흥미로운 새로운 모델입니다. 그들은 또한 우리가 다른 영장류 종의 발달을 모델링할 수 있게 해줍니다. 이 프로토콜에서는 유전자 기능을 연구하기 위해 인간 피질 오가노이드의 전기천공을 설명합니다.
오가노이드는 비브라톰으로 얇게 썰어져 주입 및 전기천공에 특히 접근하기 쉽습니다. 인간 피질 오가노이드의 전기천공법은 유전자 기능을 연구하는 강력한 기술입니다. 우리는 이 방법을 사용하여 뇌 발달과 진화에 관여하는 영장류 발현 성장 인자인 EPIREGULIN을 연구했습니다.
우리는 또한 이 방법을 사용하여 다양한 영장류 종의 인핸서 영역의 활동을 연구했습니다. 먼저 인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 인간 피질 오가노이드를 3%낮은 융점 아가로스에 삽입합니다. 비브라톰의 오가노이드를 500마이크로미터 두께의 부분으로 자릅니다.
슬라이싱 후 120rpm의 오비탈 셰이커에서 4개의 브레인 미디엄 3개를 포함하는 6웰 초저 부착 플레이트에서 오가노이드를 계속 배양합니다. 다음으로, 마이크로캐필러리 풀러를 지정된 설정으로 설정하여 주입을 위해 붕규산 유리 모세관을 당깁니다. 당긴 후에는 모세혈관을 큰 페트리 접시에 보관하고 테이프로 고정합니다.
전기천공법 당일, Tyrode의 용액을 섭씨 37도로 예열하고 CRISPR Cas9 RNP를 최종 농도인 24마이크로몰로 준비합니다. pCAG-GFP 플라스미드와 0.1%Fast Green 용액을 물에 넣어 최종 주입 혼합물에 첨가합니다. 심실과 같은 구조가 잘 발달된 인간 피질 오가노이드를 선택하고 이러한 구조가 없는 오가노이드는 폐기합니다.
최대 10개의 오가노이드를 Tyrode의 용액이 들어 있는 6cm 페트리 접시에 옮깁니다. 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 유리 마이크로캐필러리에 10마이크로리터의 주입 용액을 채웁니다. 핀셋으로 얇은 끝을 꼬집어 모세관을 엽니다.
주입 혼합물의 일부를 Tyrode의 용액에 풀어 모세관이 열려 있는지 확인합니다. 심실과 같은 구조의 중앙에 모세혈관을 삽입하고 마이크로 인젝터의 풋 스위치를 눌러 0.2-0.5 마이크로 리터의 혼합물을 주입합니다. 가는 집게를 사용하여 오가노이드를 밀어 잡지 않고 움직임을 제한합니다.
주입 후 넓은 구멍의 피펫 팁을 사용하여 1-2개의 주입된 오가노이드를 Tyrode의 용액이 포함된 전기천공실 안으로 옮깁니다. 주입된 오가노이드를 전극 쪽으로 향하게 하여 정점 요골 신경교세포와 심실 같은 영역이 바깥쪽을 향하도록 합니다. 오가노이드의 주입된 면이 양극을 향하도록 케이블을 전기천공실 챔버에 연결합니다.
electroporator의 Pulse 버튼을 눌러 38초 간격으로 각각 50밀리초 동안 1볼트의 펄스를 5개 전달합니다. electroporation 후에, 4개의 두뇌 매체 3에 인간적인 외피 organoids를 돌려보내고, 24 시간 동안 동요 없이 그(것)들을 배양하십시오. 전기천공된 인간 피질 오가노이드의 고정 및 동결 절제 후, 면역조직화학 분석을 위한 수조에서 섭씨 70도에서 1시간 동안 구연산염 완충액에서 항원 회수를 수행합니다.
PBS에서 5분 동안 섹션을 한 번 씻습니다. 그런 다음 슬라이드를 잠시 말리고 왁스 펜을 사용하여 섹션을 동그라미로 그립니다. PBS에 0.1몰 글리신을 사용하여 실온에서 30분 동안 절편을 담금질합니다.
그런 다음 PBS로 각 5분씩 절편을 두 번 씻습니다. 섹션에 블로킹 버퍼를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 밤새 1차 항체의 절편을 배양합니다.
다음 날, PBS로 각각 5분씩 섹션을 세 번 씻습니다. 2차 항체 및 DAPI가 포함된 절편을 실온에서 1시간 동안 차단 버퍼에 배양합니다. PBS로 단면을 세척한 후 장착 매체로 슬라이드를 장착하고 형광 현미경을 사용하여 단면을 이미지화합니다.
전기천공된 오가노이드의 면역조직화학(Immunohistochemistry)은 전기천공된 피질 오가노이드 내에서 오가노이드의 외부 영역에 위치한 심실과 같은 구조를 표적으로 하는 최적의 전기천공을 가진 여러 표적 심실을 밝혀냈습니다. 과도한 세포 사멸이 관찰되는 경우 문제 해결이 필요합니다. 이는 높은 플라스미드 농도 또는 차선의 전기천공법 설정으로 인해 발생할 수 있습니다.
오가노이드 내부를 향하는 전기천공법은 피질판과 같은 영역이 인접한 심실과 합쳐지기 때문에 해석하기가 더 어려운 경우가 많습니다. 과도한 주입량이나 강한 전기 펄스가 가해질 때 정점 표면의 파괴가 발생하여 심실 파열 및 세포 박리로 이어질 수 있습니다. Polycomb 억제 복합체 1 단백질 PCGF4의 녹아웃은 면역조직화학에 의해 확인되었으며, GFP 양성 세포에서 신호 강도가 감소된 것으로 나타났습니다.
GFP 양성 세포의 신호 강도 분석은 대조군에 비해 녹아웃 샘플에서 PCGF4 단백질 수치가 크게 감소한 것으로 나타났습니다.
