切片人皮质类器官的电穿孔用于基因功能研究

我的小组对调节发育中的新皮层神经祖细胞基因表达的机制感兴趣。特别是，我们关注表观遗传机制。这些对于神经祖细胞增殖和分化的潜力很重要，因此对大脑的正常发育和功能也很重要。

皮质类器官是令人兴奋的新模型，它使我们能够研究人脑的发育。它们还允许我们模拟其他灵长类动物物种的发育。在该协议中，我们描述了人皮质类器官的电穿孔以研究基因功能。

类器官用振动切片机切片，这使得它们特别容易进行注射和电穿孔。人类皮质类器官的电穿孔代表了研究基因功能的强大技术。我们使用该方法研究了灵长类动物表达生长因子 EPIREGULIN，它与大脑发育和进化有关。

我们还使用该方法研究了来自不同灵长类动物物种的增强子区域的活性。首先，将源自人诱导多能干细胞的人皮质类器官包埋在 3% 低熔点琼脂糖中。将振动切片机上的类器官切成 500 微米厚的切片。

切片后，继续在含有四种脑培养基的六孔超低附着板中培养类器官，其中三种在轨道振荡器上以 120 rpm 的速度进行。接下来，将微毛细管拉取器设置为指定设置，以拉动硼硅酸盐玻璃毛细管进行注射。拉动后，将毛细管存放在一个大培养皿中，并用胶带固定。

在电穿孔当天，将 Tyrode 溶液预热至 37 摄氏度，并制备终浓度为 24 微摩尔的 CRISPR Cas9 RNP。将 pCAG-GFP 质粒和 0.1%Fast Green 水溶液添加到最终注射混合物中。选择具有发达心室样结构的人类皮质类器官，并丢弃缺乏这些结构的类器官。

将多达 10 个类器官转移到含有 Tyrode 溶液的 6 厘米培养皿中。使用微量加载器移液器吸头，用 10 微升注射液填充玻璃微毛细管。用镊子捏掉细端，打开毛细管。

通过将一些注射混合物释放到 Tyrode 溶液中来检查毛细管是否开放。将毛细血管插入心室样结构的中心，然后按下显微注射器的脚踏开关，注射 0.2-0.5 微升混合物。使用细镊子推动类器官以限制其移动，而不抓住它。

注射后，使用大口径移液器吸头，将一到两个注射的类器官转移到含有 Tyrode 溶液的电穿孔室中。将注射的类器官朝向电极，确保顶端放射状神经胶质细胞和心室样区域朝外。将电缆连接到电穿孔室，使类器官的注射面朝向正极。

按下电穿孔仪上的脉冲按钮，以 1 秒的间隔提供 5 个 38 伏特脉冲，每个脉冲 50 毫秒。电穿孔后，将人皮质类器官放回 4 个脑介质 3 中，并在不摇晃的情况下培养 24 小时。电穿孔人皮质类器官固定和冷冻切片后，在 70 摄氏度的水浴中，在柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复 1 小时，以进行免疫组织化学分析。

在 PBS 中清洗切片一次，持续 5 分钟。然后短暂擦干载玻片，并使用蜡笔圈出切片。在室温下使用 0.1 摩尔甘氨酸的 PBS 溶液淬灭切片 30 分钟。

然后用 PBS 洗涤切片两次，每次 5 分钟。在切片上加入封闭缓冲液，并在室温下孵育 30 分钟。然后将切片在一抗中于 4 摄氏度孵育过夜。

第二天，用 PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。将切片与二抗和 DAPI 在封闭缓冲液中在室温下孵育 1 小时。用 PBS 洗涤切片后，用安装介质安装载玻片，并使用荧光显微镜对切片进行成像。

电穿孔类器官的免疫组织化学揭示了电穿孔皮质类器官内的多个目标脑室，其中最佳电穿孔靶向位于类器官外部区域的心室样结构。如果观察到过多的细胞死亡，则需要进行故障排除。这可能是由高质粒浓度或不理想的电穿孔设置引起的。

由于皮质板状区域与相邻心室合并，面向类器官内部的电穿孔通常更难解释。当施加过多的注射量或强电脉冲时，可能会发生根尖表面的破坏，导致脑室破裂和细胞分层。通过免疫组化证实了多梳抑制复合物 1 蛋白 PCGF4 的敲除，显示 GFP 阳性细胞中的信号强度降低。

GFP 阳性细胞的信号强度分析显示，与对照组相比，敲除样品中 PCGF4 蛋白水平显著降低。