הקבוצה שלי מתעניינת במנגנונים המווסתים ביטוי גנים בתאי אב עצביים של הניאו-קורטקס המתפתח. ובמיוחד, אנו מתמקדים במנגנונים אפיגנטיים. אלה חשובים לפוטנציאל של תאי אב עצביים להתרבות ולהתמיין, ולכן להתפתחות ותפקוד תקינים של המוח.
אורגנואידים קורטיקליים הם מודלים חדשים ומלהיבים המאפשרים לנו ללמוד את התפתחות המוח האנושי. הם גם מאפשרים לנו למדל את התפתחותם של מיני פרימטים אחרים. בפרוטוקול זה אנו מתארים אלקטרופורציה של אורגנואידים בקליפת המוח האנושית כדי לחקור את תפקוד הגנים.
האורגנואידים נחתכים עם ויברטום, מה שהופך אותם לנגישים במיוחד להזרקה ואלקטרופורציה. אלקטרופורציה של אורגנואידים קליפת המוח האנושית מייצגת טכניקה רבת עוצמה לחקר תפקוד גנים. השתמשנו בשיטה כדי לחקור את גורם הגדילה EPIREGULIN המבטא פרימטים, אשר מעורב בהתפתחות המוח ובאבולוציה.
השתמשנו בשיטה גם כדי לחקור את הפעילות של אזורים משפרים ממיני פרימטים שונים. בתור התחלה, הטמיעו את האורגנואידים של קליפת המוח האנושית שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם באגרוז בנקודת התכה נמוכה של 3%. פורסים את האורגנואידים על ויברטומה למקטעים בעובי 500 מיקרומטר.
לאחר החיתוך, המשיכו לגדל אורגנואידים בלוח חיבור נמוך במיוחד בעל שש בארות המכיל ארבעה מוח בינוני שלושה על שייקר אורביטלי ב-120 סל"ד. לאחר מכן, הגדר את מושך microcapillary להגדרות שצוינו כדי למשוך את נימי זכוכית borosilicate עבור זריקות. לאחר המשיכה, אחסנו את הנימים בצלחת פטרי גדולה ואבטחו אותם בנייר דבק.
ביום ההתחשמלות, מחממים מראש את התמיסה של טירודה ל 37 מעלות צלזיוס ומכינים את CRISPR Cas9 RNP בריכוז סופי של 24 מיקרומולרית. הוסיפו פלסמיד pCAG-GFP ותמיסה ירוקה מהירה 0.1% במים לתערובת ההזרקה הסופית. בחר את האורגנואידים קליפת המוח האנושית עם מבנים מפותחים דמויי חדרים והשליך את האורגנואידים החסרים מבנים אלה.
מעבירים עד 10 אורגנואידים לצלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ המכילה את התמיסה של טירוד. באמצעות קצה פיפטה microloader, למלא microcapillary זכוכית עם 10 מיקרוליטר של פתרון ההזרקה. פתח את הנימים על ידי צביטת הקצה הדק בפינצטה.
בדוק אם הנימים פתוחים על ידי שחרור חלק מתערובת ההזרקה לתמיסה של טירוד. הכנס את הנימים למרכז המבנים דמויי החדר, ולחץ על מתג כף הרגל של מיקרו-מזרק כדי להזריק 0.2-0.5 מיקרוליטר של התערובת. השתמש במלקחיים עדינים כדי לדחוף את האורגנואיד כדי להגביל את תנועתו מבלי לתפוס אותו.
לאחר ההזרקה, באמצעות קצה פיפטה רחב משעמם, להעביר אורגנואיד אחד או שניים מוזרק לתוך תא אלקטרופורציה המכיל את התמיסה של Tyrode. כיוון את האורגנואידים המוזרקים לכיוון האלקטרודות, וודא שהגליה הרדיאלית האפיקלית והאזורים דמויי החדרים פונים החוצה. חבר את הכבלים לתא האלקטרופורציה כאשר הצד המוזרק של האורגנואיד פונה לקוטב החיובי.
לחץ על לחצן הדופק באלקטרופורטור כדי לספק חמישה פולסים של 38 וולט למשך 50 אלפיות השנייה כל אחד במרווחים של שנייה אחת. לאחר התחשמלות, החזירו את האורגנואידים מקליפת המוח האנושית לארבעת המוחות הבינוניים שלוש, ותרבו אותם ללא רעד במשך 24 שעות. לאחר קיבוע והקפאה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים מחושמלים, בצע שליפת אנטיגן במאגר ציטראט למשך שעה אחת ב 70 מעלות צלזיוס באמבט מים לניתוח אימונוהיסטוכימי.
שטפו את החלקים פעם אחת ב-PBS במשך חמש דקות. לאחר מכן יבשו את המגלשות לזמן קצר והשתמשו בעט שעווה כדי להקיף את המקטעים. יש להרוות את המקטעים באמצעות 0.1 גליצין מולרי ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן שטפו את החלקים פעמיים עם PBS במשך חמש דקות כל אחד. מוסיפים חיץ חוסם למקטעים ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לדגור על החלק בנוגדנים ראשוניים למשך הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
למחרת, שטפו את החלקים שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחד. יש לדגור על המקטעים עם נוגדנים משניים ו-DAPI בחיץ חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת הקטע עם PBS, הרכיבו את השקופית עם אמצעי הרכבה ודלמו את הקטעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
אימונוהיסטוכימיה של אורגנואידים אלקטרופורטיים חשפה מספר חדרים ממוקדים בתוך אורגנואיד קליפת המוח עם אלקטרופורציות אופטימליות המכוונות למבנים דמויי חדרים הממוקמים באזורים החיצוניים של האורגנואיד. פתרון בעיות הוא הכרחי אם מוות תאי מוגזם הוא ציין. זה יכול להיגרם על ידי ריכוזי פלסמיד גבוהים או הגדרות אלקטרופורציה לא אופטימליות.
אלקטרופורציות הפונות לפנים האורגנואיד הן לעתים קרובות קשות יותר לפירוש עקב אזורים דמויי צלחת קליפת המוח המתמזגים עם חדרים סמוכים. הפרעה של פני השטח האפי עלולה להתרחש כאשר נפח הזרקה מוגזם או פולסים חשמליים חזקים מוחלים, מה שמוביל לקרעים בחדרים ודלמינציה של תאים. נוקאאוט של קומפלקס הדיכוי פוליקומב 1 חלבון PCGF4 אושר על ידי אימונוהיסטוכימיה, והראה עוצמת אות מופחתת בתאים חיוביים GFP.
ניתוח עוצמת אות של תאים חיוביים ל-GFP גילה ירידה משמעותית ברמות חלבון PCGF4 בדגימות נוקאאוט בהשוואה לקבוצת הביקורת.
