Mi grupo está interesado en los mecanismos que regulan la expresión génica en las células progenitoras neurales del neocórtex en desarrollo. Y, en particular, nos centramos en los mecanismos epigenéticos. Estos son importantes para el potencial de las células progenitoras neurales para proliferar y diferenciarse y, por lo tanto, para el desarrollo y la función adecuados del cerebro.
Los organoides corticales son nuevos y emocionantes modelos que nos permiten estudiar el desarrollo del cerebro humano. También nos permiten modelar el desarrollo de otras especies de primates. En este protocolo, describimos la electroporación de organoides corticales humanos para estudiar la función de los genes.
Los organoides se cortan con un vibrótomo, lo que los hace especialmente accesibles para la inyección y la electroporación. La electroporación de organoides corticales humanos representa una poderosa técnica para estudiar la función de los genes. Hemos utilizado el método para estudiar el factor de crecimiento expreso de los primates, la epiregulina, que está implicado en el desarrollo y la evolución del cerebro.
También hemos utilizado el método para estudiar la actividad de las regiones potenciadoras de diferentes especies de primates. Para empezar, incruste los organoides corticales humanos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos en agarosa de bajo punto de fusión al 3%. Corta los organoides en un vibratomo en secciones de 500 micrómetros de grosor.
Después de cortar, continúe cultivando organoides en una placa de fijación ultra baja de seis pocillos que contenga cuatro cerebros medianos tres en un agitador orbital a 120 rpm. A continuación, configure el extractor de microcapilares en la configuración especificada para extraer los capilares de vidrio de borosilicato para inyecciones. Después de tirar, guarde los capilares en una placa de Petri grande y asegúrelos con cinta adhesiva.
El día de la electroporación, precalentar la solución de Tyrode a 37 grados centígrados y preparar el CRISPR Cas9 RNP a una concentración final de 24 micromolares. Añada el plásmido pCAG-GFP y la solución Fast Green al 0,1 % en agua a la mezcla de inyección final. Seleccione los organoides corticales humanos con estructuras ventricles bien desarrolladas y descarte los organoides que carezcan de estas estructuras.
Transfiera hasta 10 organoides a una placa de Petri de 6 centímetros que contenga la solución de Tyrode. Con la punta de una pipeta de microcargador, llene un microcapilar de vidrio con 10 microlitros de la solución inyectable. Abra el capilar pellizcando el extremo delgado con unas pinzas.
Compruebe si el capilar está abierto liberando parte de la mezcla de inyección en la solución de Tyrode. Inserte el capilar en el centro de las estructuras similares a ventrículos y presione el interruptor de pie de un microinyector para inyectar de 0,2 a 0,5 microlitros de la mezcla. Use pinzas finas para empujar el organoide para restringir su movimiento sin agarrarlo.
Después de la inyección, utilizando una punta de pipeta de diámetro ancho, transfiera uno o dos organoides inyectados a una cámara de electroporación que contenga la solución de Tyrode. Oriente los organoides inyectados hacia los electrodos, asegurándose de que la glía radial apical y las regiones similares a los ventrículos miren hacia afuera. Conecte los cables a la cámara de electroporación con el lado inyectado del organoide hacia el polo positivo.
Presione el botón de pulso en el electroporador para entregar cinco pulsos de 38 voltios durante 50 milisegundos cada uno a intervalos de 1 segundo. Después de la electroporación, devuelva los organoides corticales humanos a los cuatro cerebros y cultívelos sin agitar durante 24 horas. Después de la fijación y criosección de organoides corticales humanos electroporados, realizar la recuperación de antígenos en tampón de citrato durante una hora a 70 grados Celsius en un baño de agua para el análisis inmunohistoquímico.
Lave las secciones una vez en PBS durante cinco minutos. A continuación, seca los portaobjetos brevemente y utiliza un bolígrafo de cera para rodear las secciones. Apague las secciones con glicina molar 0.1 en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, lave las secciones dos veces con PBS durante cinco minutos cada una. Agregue tampón de bloqueo a las secciones e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, incubar la sección en anticuerpos primarios durante la noche a 4 grados centígrados.
Al día siguiente, lave las secciones tres veces con PBS durante cinco minutos cada una. Incubar las secciones con anticuerpos secundarios y DAPI en un tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar la sección con PBS, monte el portaobjetos con medio de montaje y tome imágenes de las secciones con un microscopio fluorescente.
La inmunohistoquímica de organoides electroporados reveló múltiples ventrículos dirigidos dentro de un organoide cortical electroporado con electroporaciones óptimas dirigidas a estructuras similares a ventrículos ubicadas en las regiones externas del organoide. La solución de problemas es necesaria si se observa una muerte celular excesiva. Esto puede deberse a altas concentraciones de plásmidos o a ajustes de electroporación subóptimos.
Las electroporaciones que miran hacia el interior del organoide suelen ser más difíciles de interpretar debido a que las áreas en forma de placas corticales se fusionan con los ventrículos adyacentes. La disrupción de la superficie apical puede ocurrir cuando se aplica un volumen de inyección excesivo o pulsos eléctricos fuertes, lo que lleva a rupturas de ventrículos y delaminación celular. El knockout de la proteína PCGF4 del complejo represor Polycomb 1 se confirmó mediante inmunohistoquímica, mostrando una intensidad de señal reducida en las células GFP positivas.
El análisis de la intensidad de la señal de las células GFP positivas reveló una reducción significativa en los niveles de proteína PCGF4 en las muestras knockout en comparación con los controles.
