Il mio gruppo è interessato ai meccanismi che regolano l'espressione genica nelle cellule progenitrici neurali della neocorteccia in via di sviluppo. E in particolare, ci concentriamo sui meccanismi epigenetici. Questi sono importanti per il potenziale delle cellule progenitrici neurali di proliferare e differenziarsi, e quindi per il corretto sviluppo e funzione del cervello.
Gli organoidi corticali sono nuovi entusiasmanti modelli che ci permettono di studiare lo sviluppo del cervello umano. Ci permettono anche di modellare lo sviluppo di altre specie di primati. In questo protocollo, descriviamo l'elettroporazione di organoidi corticali umani per studiare la funzione genica.
Gli organoidi vengono affettati con un vibratomo, che li rende particolarmente accessibili per l'iniezione e l'elettroporazione. L'elettroporazione di organoidi corticali umani rappresenta una potente tecnica per studiare la funzione genica. Abbiamo usato il metodo per studiare il fattore di crescita EPIREGULIN, che è implicato nello sviluppo e nell'evoluzione del cervello.
Abbiamo anche utilizzato il metodo per studiare l'attività delle regioni enhancer di diverse specie di primati. Per iniziare, incorporare gli organoidi corticali umani derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo in agarosio a basso punto di fusione al 3%. Affettare gli organoidi su un vibratomo in sezioni spesse 500 micrometri.
Dopo l'affettatura, continuare a coltivare gli organoidi in una piastra di attacco ultra-bassa a sei pozzetti contenente quattro medium cerebrali tre su un agitatore orbitale a 120 giri/min. Quindi, impostare l'estrattore microcapillare sulle impostazioni specificate per estrarre i capillari in vetro borosilicato per le iniezioni. Dopo l'estrazione, conservare i capillari in una grande capsula di Petri e fissarli con del nastro adesivo.
Il giorno dell'elettroporazione, preriscaldare la soluzione di Tyrode a 37 gradi Celsius e preparare l'RNP CRISPR Cas9 a una concentrazione finale di 24 micromolari. Aggiungere il plasmide pCAG-GFP e la soluzione Fast Green allo 0,1% in acqua alla miscela finale per iniezione. Selezionare gli organoidi corticali umani con strutture ventricolari ben sviluppate e scartare gli organoidi che mancano di queste strutture.
Trasferire fino a 10 organoidi in una capsula di Petri di 6 centimetri contenente la soluzione di Tyrode. Utilizzando un puntale per pipetta microloader, riempire un microcapillare di vetro con 10 microlitri di soluzione iniettabile. Aprire il capillare pizzicando l'estremità sottile con una pinzetta.
Controllare se il capillare è aperto rilasciando parte della miscela per iniezione nella soluzione di Tyrode. Inserire il capillare al centro delle strutture ventricolari e premere l'interruttore a pedale di un microiniettore per iniettare 0,2-0,5 microlitri della miscela. Usa una pinza fine per spingere l'organoide per limitarne il movimento senza afferrarlo.
Dopo l'iniezione, utilizzando un puntale per pipetta a foro largo, trasferire uno o due organoidi iniettati in una camera di elettroporazione contenente la soluzione di Tyrode. Orientare gli organoidi iniettati verso gli elettrodi, assicurandosi che la glia radiale apicale e le regioni ventricolari siano rivolte verso l'esterno. Collegare i cavi alla camera di elettroporazione con il lato iniettato dell'organoide rivolto verso il polo positivo.
Premere il pulsante Pulse sull'elettroporatore per erogare cinque impulsi di 38 volt per 50 millisecondi ciascuno a intervalli di 1 secondo. Dopo l'elettroporazione, riportare gli organoidi corticali umani al mezzo cerebrale tre e coltivarli senza agitarli per 24 ore. Dopo la fissazione e la criosezione di organoidi corticali umani elettroporati, eseguire il recupero dell'antigene in tampone citrato per un'ora a 70 gradi Celsius in un bagno d'acqua per l'analisi immunoistochimica.
Lavare le sezioni una volta in PBS per cinque minuti. Quindi asciugare brevemente le diapositive e utilizzare una penna a cera per cerchiare le sezioni. Estinguere le sezioni utilizzando 0,1 molari di glicina in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
Quindi lavare le sezioni due volte con PBS per cinque minuti ciascuna. Aggiungere un tampone bloccante sulle sezioni e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi incubare la sezione in anticorpi primari per una notte a 4 gradi Celsius.
Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte con PBS per cinque minuti ciascuna. Incubare le sezioni con anticorpi secondari e DAPI in un tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver lavato la sezione con PBS, montare il vetrino con il supporto di montaggio e visualizzare le sezioni utilizzando un microscopio a fluorescenza.
L'immunoistochimica degli organoidi elettroporati ha rivelato più ventricoli mirati all'interno di un organoide corticale elettroporato, con elettroporazioni ottimali mirate a strutture ventricolari situate nelle regioni esterne dell'organoide. La risoluzione dei problemi è necessaria se si osserva un'eccessiva morte cellulare. Ciò può essere causato da alte concentrazioni di plasmidi o impostazioni di elettroporazione non ottimali.
Le elettroporazioni rivolte verso l'interno dell'organoide sono spesso più difficili da interpretare a causa delle aree simili a placche corticali che si fondono con i ventricoli adiacenti. La rottura della superficie apicale può verificarsi quando viene applicato un volume di iniezione eccessivo o forti impulsi elettrici, con conseguente rottura del ventricolo e delaminazione cellulare. Il knockout della proteina PCGF4 del complesso repressivo Polycomb 1 è stato confermato dall'immunoistochimica, mostrando una ridotta intensità del segnale nelle cellule GFP positive.
L'analisi dell'intensità del segnale delle cellule GFP positive ha rivelato una riduzione significativa dei livelli di proteina PCGF4 nei campioni knockout rispetto ai controlli.
