电离辐射的反应定量的γH2AX灶

摘要

DNA双链分子标记γH2AX形成条纹的量化已成为辐射生物学中的一个非常宝贵的工具。在这里，我们表现出免疫荧光法检测细胞对辐射的暴露后γH2AX灶的定量使用。

摘要

DNA双链断裂（DSB的），这是无论是内源性代谢过程或外源性​​诱导，是最关键的DNA损伤一个方面的生存和保持基因组完整性。早期反应的双链断裂感应是组蛋白H2A变体，H2AX的磷酸化，丝氨酸139残留，在高度保守的C -末端SQEY图案，形成γH2AX

研究方案

细胞制备

1. 生长在角质形成细胞无血清培养人角质形成细胞（FEP - 1811）（K - SFM; Invitrogen公司）与表皮生长因子，牛垂体提取物和20微克/毫升庆大霉素的补充，在37 ° C和5％的_CO 2 。
2. 用胰酶- EDTA（0.05％V / V）分离制备单细胞悬液
3. 细胞接种于8实验室TEK第二microchamber幻灯片（万细胞/孔）和幻灯片，在37 ° C和5％的CO ₂孵育3天。

放射

1. 冰使用^{的137 Cs}源（1000 Gammacell精英辐照; Nordion公司国际上，加拿大; 20.6秒/ GY）与2戈瑞辐照细胞
2. 未经辐照的控制和2 Gy照射细胞孵育1小时37 ° C和5％的_CO 2 。

免疫荧光染色

1. 媒体通风报信，洗涤细胞，每孔300μL的PBS（W / O CA ^{2 +}或Mg ^{2 +的} ），并在5分钟的轨道混频器的旋转。
2. 缓冲区是通风报信，新鲜配制的4％多聚甲醛（V / V），每孔加入幻灯片在室温下孵育10分钟100μL。
   所有孵化加湿染色槽
3. 细胞，然后用PBS（W / O型的Ca ^{2 +，Mg 2 +的} ）。 5分钟的轨道混频器，幻灯片被放置在一个Coplin JAR和旋转。此清洗步骤再重复两次。
4. 缓冲区是通风报信，多余的PBS轻轻涂抹。
5. 使用100毫升TRITON X - 100（0.1％V / V），每口井，在室温下孵育10分钟的细胞透。
6. 细胞，用PBS冲洗（W / O型的Ca ^{2 +}或Mg ^{2 +的} ）如在上述步骤3和4中所述
7. 在室温下（1％V / V）与BSA的100毫升的非特异性蛋白结合，阻止每口井和20分钟的孵育。
8. 多余的BSA是通风报信，鼠抗磷酸化组蛋白H2AX的抗体（1:500稀释，在1％BSA; Millipore公司）100μL，在室温下孵育1小时，每口井。
9. 细胞用PBS冲洗（W / O型的Ca ^{2 +}或Mg ^{2 +）}的步骤3和第4段中所述和培养100μL二次抗体（的Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG稀释1:500，在1％BSA ; Invitrogen公司），每45分钟，在室温下在黑暗中。 （摊薄抗体，整个过程被蒙在鼓里）
10. 细胞，用PBS冲洗（W / O型的Ca ^{2 +}或Mg ^{2 +的} ）如在上述步骤3和4中所述然而，暴露在光线下是最小化使用铝箔。
11. 核counterstaining是用100ml TOPRO3（稀释1:500; Invitrogen公司）进行，每口井，在室温下孵育10分钟的
12. 细胞用PBS（W / O型的Ca ^{2 +}或Mg ^{2 +）}在第10步以上所述。
13. 该商会进行了仔细从幻灯片中删除多余的水分，涂抹和幻灯片被允许空气干燥。
14. 延长金防褪色的解决方案（Invitrogen）的下降，每孔加入幻灯片安装（22x50毫米盖玻片）和幻灯片的边缘周围的任何多余的液体被抹杀。
15. 被关在黑暗为进一步在室温下30分钟，然后用指甲油密封幻灯片。
16. 幻灯片一夜之间被储存在4 ° C的分析前的黑暗。

显微镜/分析

1. 蔡司LSM510 META共焦Microscpe用来获取图像，使用标准的绿色荧光蛋白（γH2AX - 的Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG）和远红光激光器（TOPRO - 3）。通常，一个63 ×油浸物镜使用。
   一个0.5微米的一步大小，图像采集在Z系列模式。一个0.5微米的一步大小选择不同的平面，以尽量减少损失灶目前在细胞核。在分析过程中，个别飞机卷积和堆放产生一个最大投射影像的疫源地，以尽量减少重叠（顶帽子过滤器适用于）。
2. Metamorph分子器件，（美国）是用来分析疫源地的数量。
   该计划定量灶，在每个单元的阈值后，已被应用到排除的背景。该信息被记录在Microsoft Excel电子表格，作进一步的分析。

图1。γH2AX灶（绿色）的免疫可视化未经处理的人角质形成细胞和细胞在2 Gy的照射，并为进一步的1小时在_37℃，5％的CO 2。 DNA染色TOPRO - 3（蓝色）。使用的Zeiss LSM 510 META激光共聚焦显微镜获得的图像。酒吧= 10微米。

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图2。γH2AX灶（绿色）的免疫可视化在人类角质形成细胞和细胞在2 Gy的照射，并为进一步的1小时在_37℃，5％的CO 2。图片被收购使用的Zeiss LSM 510元共聚焦显微镜使用0.5微米的Z -切片（1-9），以确保所有灶被收购。的图像，然后堆放定量使用Metamorph。 DNA染色TOPRO - 3（蓝色）。堆叠堆叠γH2AX和蓝色的图像可视化。酒吧= 10微米。

讨论

暴露于电离辐射（γ射线），γH2AX灶形式迅速和疫源地号码后达到最大，在30-60 ^分钟之间2。因此，1小时后照射时间点反映初始DSB的形成。我们的实验中，我们已经用2 Gy的临床相关的辐射剂量。然而，该方法可用于辐射剂量高达4戈瑞检测初始DSB的形成;灶明显的重叠排除在较高剂量准确定量。可用于更高的辐射剂量辐照后的潜伏期较长时间，γH2AX灶因维修，造成量化的数字。通常情况下，4...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)	Media	Invitrogen	17005042	Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE).
Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)	Chamber Slides	Nalge Nunc international	NUN154534
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
0.5% Trypsin-EDTA x10		Invitrogen	15400-054	Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	Refractive index of 1.42 at 20°C.
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Tissue Culture Dish (150x25mm)	Petridish	BD Biosciences	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices