電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化

要約

分子マーカーとしてγH2AX形成を用いてDNA二本鎖縞の定量化は、放射線生物学における非常に貴重なツールとなっています。ここでは、放射線に対する細胞の曝露後のγH2AX病巣の定量化のための免疫蛍光アッセイの使用方法を示しています。

要約

内因性の代謝プロセスによって、または外因性の要因によって誘発されるDNA二重鎖切断（DSB）は、ゲノムの完全性の生存と保全に関して、最も重要なDNA損傷の一つです。 DSBが誘導に早期の反応はγH2AXを形成し、高度に保存されたC末端SQEYモチーフに、セリン- 139残基において、H2Aヒストンバリアント、H2AXのリン酸化です。

プロトコル

細胞の準備

1. ℃、5％CO ₂で37、上皮成長因子、ウシ下垂体抽出物と20μg/ mlのゲンタマイシンを補った、ヒトケラチノサイト（FEP - 1811）は、ケラチノサイト、無血清培地（Invitrogen社製K - SFM）で増殖させた。
2. 単一の細胞懸濁液をトリプシン- EDTA（0.05％v / v）で切り離すことによって調製した
3. 細胞は8ウェルラボテックIIマイクロチャンバースライドに播種（10,000細胞/ウェル）とスライドは、37℃、5％CO ₂で3日間インキュベートした。

照射

1. 細胞は^{、137 Cs}のソース（; Nordionインターナショナル、カナダ、ON、20.6秒/ GyをGammacell 1000年エリート照射器）を用いて、2 Gyで氷の上に照射された
2. 非照射コントロールと2 Gyの照射された細胞は37℃、5％CO ₂で1時間インキュベートした。

免疫蛍光染色

1. メディアは、オフチップを渡したし、細胞をウェルあたりPBSの300μl（W / OのCa ^{2 +}またはMg ^{2 +）}で洗浄し、5分間オービタルミキサー上で回転であった。
2. バッファはオフチップを渡したとパラホルムアルデヒドを各ウェルに添加し、スライドを室温で10分間インキュベートし、新たに調製した4％（v / v）を100μlのした。
   すべてのインキュベーションは加湿染色トラフで実施された
3. 次いで、細胞をPBS（W / OのCa ^{2 +}またはMg ^{2 +）}で洗浄した。スライドを5分間軌道ミキサーにコプリンジャーと回転に置かれた。この洗浄ステップは、さらに2回繰り返した。
4. バッファはオフチップを渡したされ、過剰のPBSを穏やかにブロットした。
5. 細胞は100ミリリットルトリトンX - 100（0.1％v / v）のウェル当たり、室温で10分間のインキュベーションを用いて透過処理された。
6. 細胞をPBSで洗浄し（W / OのCa ^{2 +}またはMg ^{2 +）}として手順3および4で説明されている。
7. 非特異的タンパク質の結合は室温でウェルあたりBSAの100ミリリットル（1％v / v）を、20分間のインキュベーションでブロックした。
8. 過剰BSAは、オフチップを渡したされ、一次マウスモノクローナル抗リン酸化ヒストン- H2AX抗体（1％BSAで、1:500に希釈し、ミリポア）100μlのは、室温で1時間のインキュベーションのために各ウェルに添加した。
9. 細胞をPBSで洗浄し（W / OのCa ^{2 +}またはMg ^{2 +）}として、上記の手順3と4で説明されていると二次抗体液100μl（のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗マウスIgGとインキュベートは1％BSAで、1:500に希釈、暗所で室温にて45分間、ウェルあたりInvitrogen社）。 （希薄化抗体は、プロシージャ全体に暗所で保管された）
10. 細胞をPBSで洗浄し（W / O ^{カルシウム}イオン又はMg ^{2 +）}として手順3および4で説明されている。しかし、光への曝露は、箔を用いて最小化した。
11. 核の対比は、100ミリリットルTOPRO3（1:500に希釈;インビトロジェン社）を用いて行ったウェルあたり、室温で10分間のインキュベーション
12. 細胞は、上記の手順10で説明されているPBS（W / OのCa ^{2 +}またはMg ^{2 +）}で洗浄した。
13. チャンバーを慎重にスライドから削除された、余分な水分を吸い取りされ、スライドを空気乾燥された。
14. GOLD抗フェード液（Invitrogen）を褪色の一滴ごとによく添加し、スライドがマウントされた（22x50ミリメートルカバー）とスライドのエッジの周りに余分な液体をブロットした。
15. スライドはマニキュアで密封する前に、さらに室温で30分間暗所に格納されていました。
16. スライドは4℃で一晩保存した° C分析の前に暗闇の中で。

顕微鏡/分析

1. ツァイスLSM510メタ焦点標準GFPを使って画像を取得するために使用されるMicroscpe（γH2AXのための - のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗マウスIgG）と遠赤色レーザー（TOPRO - 3）。通常は、63 ×油浸対物レンズが使用されます。
   画像は、0.5μmのステップサイズとZシリーズのパターンで取得されています。 0.5μmのステップサイズは、核内の別の面での焦点の現在の損失を最小限に抑えるために選ばれました。分析中に、個々の平面は巣（トップハットフィルタが適用された）の重複を最小限に抑えるために最大限の投影画像を生成するデコンボリューションと積層される。
2. Metamorph（Molecular Devices社、米国）は、病巣の数を分析するために使用されました。
   しきい値がバックグラウンドを排除するために適用された後のプログラムは、各セル内の病巣の数をquantitates。情報をさらに分析するためのMicrosoft Excelスプレッドシートに記録されます。

図1未治療のヒトケラチノサイトにおいて、2 Gyで照射し、37℃でさらに1時間インキュベートした細胞でγH2AX病巣（緑）の免疫蛍光可視化° C、5％CO _2。 DNAはTOPRO - 3（青）で染色した。画像は、ツァイスLSM 510メタ共焦点顕微鏡を用いて取得した。バー= 10μmの。

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図2ヒトケラチノサイトにおいて、2 Gyで照射し、37℃でさらに1時間インキュベートした細胞でγH2AX病巣（緑）の免疫蛍光可視化° C、5％CO _2。画像は、巣が取得されたすべてを確実にするために、Z -セクショニング（1-9）は0.5μmを使用してツァイスLSM 510メタ共焦点顕微鏡を用いて取得した。画像はMetamorphを使用して定量化に積層した。 DNAはTOPRO - 3（青）で染色した。スタックγH2AXと青のイメージが可視化のために積層した。バー= 10μmの。

ディスカッション

電離放射線（γ線）、急速にγH2AX巣の形と巣の番号への曝露後には30〜60分²との間で最大に達する。したがって、私たちの1時間照射後の時点では、初期のDSBの形成を反映している。我々は我々の実験に2 Gyの臨床的に関連する放射線量を使用している。しかし、方法は、初期のDSBの形成の検出を4 Gyに被曝線量のために、最大使用することができます。巣の大幅なオーバーラップは高用?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)	Media	Invitrogen	17005042	Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE).
Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)	Chamber Slides	Nalge Nunc international	NUN154534
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
0.5% Trypsin-EDTA x10		Invitrogen	15400-054	Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	Refractive index of 1.42 at 20°C.
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Tissue Culture Dish (150x25mm)	Petridish	BD Biosciences	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices