Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

요약

분자 마커로 γH2AX 형성을 사용하여 DNA 이중 스트랜드 줄무늬의 부량 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 방사선에 노출 후 세포의 γH2AX foci의 부량위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

초록

내생 신진 대사 과정 중 또는 외인성 소스에 의해 유도된 아르 DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)는, 게놈 무결성 생존과 보존에 관한 가장 중요한 DNA의 병변 중 하나입니다. DSBs의 유도에 초기 반응은 γH2AX을 형성, 높​​은 보존 C - 터미널 SQEY의 모티브에서 세린 - 139 잔여물에서 H2A 히스톤 변형, H2AX의 인산화입니다

프로토콜

셀 준비

1. 37, 표피 성장 인자, 소 뇌하수체 추출물 및 20 μg / ML gentamicin과 보충 ° C와 5% CO _2; 인간 keratinocytes (FEP - 1811)은 (Invitrogen K - SFM) Keratinocyte - 세럼 무료 매체 성장했다.
2. 단일 세포 현탁액은 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.05 % V / V)로 분리하여 준비했습니다
3. 전지는 8 잘 연구실 테크 II microchamber 슬라이드에서 씨앗을 품고 있었다 (10,000 셀 / 음)과 슬라이드가 37 ° C와 5 % CO _2에서 3 일간 incubated되었습니다.

조사

1. 세포는 ¹³⁷ 고사 소스를 (; Nordion 국제, ON, 캐나다, 20.6 초 / 쥐 Gammacell 1000 엘리트 irradiator)를 사용하여이 쥐와 함께 얼음에 조사되었다
2. Unirradiated 제어 및 2 쥐 조사 전지는 37 ° C와 5% CO _2에서 1 시간 동안 incubated되었습니다.

Immunofluorescence 염색법

1. 미디어는 밀고되어 세포가 잘 당 PBS의 300μl (W / O 칼슘 ^{2 +} 또는 MG ^{2 +)로} 씻어 5 분 동안 궤도 믹서에 회전 하였다.
2. 버퍼는 밀고와 paraformaldehyde 각 잘 추가되었고 슬라이드가 10 분 동안 상온에서 incubated 있었다 신선한 4퍼센트 (V / V)의 100μl했습니다.
   모든 incubations은 humidified 얼룩 트러프에서 수행되었다
3. 전지는 다음 PBS (W / O 칼슘 ^{2 +} 또는 MG ^{2 +)로} 세탁했다. 슬라이드가 5 분 궤도 믹서에 코플린 병 및 회전에 배치했다. 이 세척 단계는 더 이상 두 번 반복되었다.
4. 버퍼 밀고했고 초과 PBS는 부드럽게 blotted되었습니다.
5. 세포 100ml 트리톤 X - 100 (0.1 % V / V) 당 잘하고 실온에서 10 분 배양을 사용하여 permeabilized되었습니다.
6. 세포 PBS로 씻은했다 (W / O 칼슘 ^{2 +} 또는 MG ^{2 +)와} 같은 3 단계 이상 4 설명했다.
7. 비 - 특정 단백질 바인딩은 상온에서 잘하고 이십분 부화 당 BSA의 100ml (1 % V / V)로 차단되었습니다.
8. 초과 BSA는 밀고되었으며 기본 마우스 단클론 항 phospho - H2AX 히스톤 항체 (1 % BSA에 1:500 희석, Millipore)의 100μl는 상온에서 1 시간 배양 각 잘 추가되었습니다.
9. 세포 PBS로 씻은했다 (W / O 칼슘 ^{2 +} 또는 MG ^{2 +)} 위의 3 단계와 4 단계에서 설명한 및 보조 항체의 100μl (알렉사 플루어 488 염소 방지 마우스 IgG와 incubated 1 % BSA에 1:500 희석 ; Invitrogen) 어둠 속에서 실온에서 45 분간 잘마다. (희석 항체가 절차를 통해 어둠에 보관되었습니다)
10. 세포 PBS로 씻은했다 (W / O 칼슘 ^{2 +} 또는 MG ^{2 +)와} 같은 3 단계 이상 4 설명했다. 그러나, 빛에 노출 호일을 사용하여 최소화했다.
11. 잘 따라와 실온에서 10 분 배양, 핵 counterstaining은 100ml TOPRO3 (Invitrogen 1:500 희석)으로 수행되었습니다
12. 전지는 PBS (W / O 칼슘 ^{2 +} 또는 MG ^{2 +)가로} 씻은 것처럼 위의 단계 10 설명했다.
13. 챔버 스는 조심스럽게 슬라이드에서 제거되었습니다, 과잉 수분이 blotted되었고 슬라이드는 건조 공기를 허용되었다.
14. GOLD 방지 퇴색 솔루션 (Invitrogen)를 연장 중 하나는 방울마다 잘 추가되었습니다과 슬라이드가 탑재되었다 (22x50 mm coverslip) 및 슬라이드의 가장자리 주위에 초과 액체는 bl​​otted되었습니다.
15. 슬라이드는 매니큐어로 밀봉하기 전에 실온에서 추가로 30 분 어둠에 보관했다.
16. 슬라이드 4에서 하룻밤 저장된 ° C 분석하기 전에 어둠 속이라서.

현미경 / 분석

1. (- 알렉사 플루어 488 염소 안티 - 마우스 IgG γH2AX)과 멀리 붉은 레이저 (TOPRO - 3) 자이스 혈구 LSM510 메타 공촛점 Microscpe은 표준 GFP를 사용하여 이미지를 획득하는 데 사용됩니다. 일반적으로 63 X 오일 침지 객관적인 렌즈가 사용됩니다.
   이미지는 0.5 μm의의 스텝 크기와 Z - 시리즈 패턴에 인수됩니다. 0.5 μm의의 단계 크기는 핵에서 다른 비행기에 foci 선물의 손실을 최소화하기 위해 선정되었습니다. 분석하는 동안, 개인 비행기는 deconvoluted 및 foci의 중복 (톱 - 모자 필터 적용)를 최소화하기 위해 최대 예상 이미지를 생산하기 위해 정렬됩니다.
2. Metamorph (분자 디바이스, 미국)는 foci의 개수를 분석하는 데 사용되었다.
   임계값이 배경을 제외 적용된 후이 프로그램은 각 셀에 foci의 수를 quantitates. 이 정보는 추가 분석을 위해 Microsoft Excel 스프레드 시트에 기록됩니다.

그림 1. 치료 인간 keratinocytes에서 2 쥐와 조사 37에서 추가로 1 시간 동안 incubated 세포 γH2AX foci (녹색)의 Immunofluorescence 시각화 ° C 5 % CO _2. DNA는 TOPRO - 3 (블루) 물들일했습니다. 이미지 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 현미경을 사용하여 인수했다. 바 = 10 μm의.

e_content ">
그림 2. 인간 keratinocytes에서 2 쥐와 조사 37에서 추가로 1 시간 동안 incubated 세포 γH2AX foci (녹색)의 Immunofluorescence 시각화 ° C 5 % CO _2. 이미지는 모든 foci가 인수되었습니다 보장하기 위해 0.5 μm의 Z - sectioning (1-9)를 사용하여 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 현미경을 사용하여 인수했다. 이미지는 다음 Metamorph를 사용하여 quantitation 위해 쌓아했다. DNA는 TOPRO - 3 (블루) 물들일했습니다. 스택 γH2AX 및 파랑 이미지는 시각화를 위해 쌓아되었습니다. 바 = 10 μm의.

토론

이온화 방사선 (γ 선), 빠르게 γH2AX foci 양식 및 foci 번호를 다음 노출 30~60분 ² 사이 최대에 도달. 따라서, 우리 1시간 후 방사선 시점은 초기 DSB 형성을 반영합니다. 우리는 우리의 실험 2 쥐의 임상 관련 방사선 선량을 사용했습니다. 그러나 방법은 초기 DSB 형성의 검출 4 쥐 위해 방사선 접종에 사용할 수있는, foci 상당한 중복 높은 복용에 정확한 quantitation 걸로. γH2AX foci가 같지는 숫자 결?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)	Media	Invitrogen	17005042	Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE).
Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)	Chamber Slides	Nalge Nunc international	NUN154534
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
0.5% Trypsin-EDTA x10		Invitrogen	15400-054	Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	Refractive index of 1.42 at 20°C.
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Tissue Culture Dish (150x25mm)	Petridish	BD Biosciences	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices