Количественная оценка γH2AX Очаги в ответ на ионизирующего излучения

Резюме

Количественная оценка ДНК двухцепочечной полосы использованием γH2AX формирование как молекулярный маркер стал бесценным инструментом в области радиационной биологии. Здесь мы демонстрируем использование иммунофлуоресценции для количественного определения γH2AX очагов после контакта клеток к радиации.

Аннотация

ДНК двунитевых разрывов (ДР), которые индуцируются или эндогенных процессов обмена веществ или экзогенными источниками, являются одним из самых критических повреждений ДНК в отношении выживания и сохранения целостности генома. Ранний ответ на индукции ДР является фосфорилирование гистонов H2A вариант, H2AX, на серин-139 остатка, в хорошо сохранились и С-концевой мотив SQEY, образуя γH2AX

протокол

Сотовые подготовка

1. Кератиноцитов человека (FEP-1811) были выращены в кератиноцитов-бессывороточной среде (K-УЛП; Invitrogen) с добавлением эпидермального фактора роста, бычий гипофизарный экстракт и 20 мкг / мл гентамицина, при 37 ° С и 5% СО _2.
2. Суспензии отдельных клеток, был подготовлен отсоединения трипсином-ЭДТА (0,05% об / об)
3. Клетки высевают в 8-и Лаборатории Tek II слайды микрокамере (10000 клеток / лунку) и слайды инкубировали в течение 3 дней при температуре 37 ° C и 5% СО _2.

Облучение

1. Клетки облучали на льду с использованием 2 Гр ¹³⁷ Cs источника (Gammacell 1000 Elite облучателя; Nordion International, ON, Канада; 20,6 секунды / Гр)
2. Необлученный контроля и 2 Гр облученных клеток инкубировали в течение 1 часа при температуре 37 ° С и 5% СО _2.

Иммунофлуоресценции окрашивание

1. СМИ была наклонили и клетки промывали 300 мкл ФСБ (без Са ^{2 +} или Mg ^{2 +)} в каждую лунку и были повернуты на орбитальной смесителя в течение 5 минут.
2. Буфера наклонили и 100 мкл свежеприготовленного 4% (объем / объем) параформальдегида был добавлен в каждую лунку и слайды инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут.
   Все инкубации проводили в увлажненной корыта окрашивание
3. Затем клетки промывали PBS (без Са ^{2 +} или Mg ^{2 +).} Слайды были помещены в банки Коплин и повернуты на орбитальной смесителя в течение 5 минут. Этот шаг был мыть повторяется еще два раза.
4. Буфера наклонили и избыток PBS мягко уничтожены.
5. Клетки были проницаемыми использованием 100мл Тритон Х-100 (0,1% об / об) в каждую лунку и 10 минут инкубации при комнатной температуре.
6. Клетки промывали PBS (без Са ^{2 +} или Mg ^{2 +),} как описано в шагах 3 и 4 выше.
7. Неспецифические связывания с белками был блокирован с 100 мл BSA (1% об / об) на одну скважину и 20 минут инкубации при комнатной температуре.
8. Превышение БСА наклонили и 100 мкл первичных мышиных моноклональных анти-фосфо-гистон H2AX антител (разбавленной 1:500, в 1% BSA; Millipore), был добавлен в каждую лунку за 1 час инкубации при комнатной температуре.
9. Клетки промывали PBS (без Са ^{2 +} или Mg ^{2 +),} как описано в шагах 3 и 4 выше, и инкубируют с 100 мкл вторичных антител (Alexa Fluor 488 антимышиного IgG разбавленной 1:500, в 1% BSA ; Invitrogen) на скважину в течение 45 минут при комнатной температуре в темноте. (Разводненная антител был в неведении в течение всей процедуры)
10. Клетки промывали PBS (без Са ^{2 +} или Mg ^{2 +),} как описано в шагах 3 и 4 выше. Тем не менее, воздействие света было сведено к минимуму использование фольги.
11. Ядерная counterstaining была выполнена с 100 мл TOPRO3 (разбавленным 1:500; Invitrogen) на скважину и 10 минут инкубации при комнатной температуре
12. Клетки промывали PBS (без Са ^{2 +} или Mg ^{2 +),} как описано в пункте 10 выше.
13. Камеры были тщательно удалены из слайдов, избыток влаги уничтожены и слайды было позволено высохнуть на воздухе.
14. Одна капля Продли ЗОЛОТО анти-Fade решение (Invitrogen) был добавлен в каждую лунку и слайды были установлены (22x50 мм покровным) и лишнюю жидкость по краям слайд был уничтожены.
15. Слайды держали в темноте в течение еще 30 минут при комнатной температуре до уплотнения с лаком для ногтей.
16. Слайды, хранились в течение ночи при 4 ° С в темноте перед проведением анализа.

Микроскопия / Анализ

1. Zeiss LSM510 Мета конфокальной Microscpe использоваться для получения изображений с помощью стандартного GFP (для γH2AX - Alexa Fluor 488 антимышиного IgG) и дальнего красного лазеров (для TOPRO-3). Как правило, 63 х нефти погружения объектива используется.
   Изображения, приобретенных в Z-серии модель с шагом в 0,5 мкм. Размер шага 0,5 мкм была выбрана, чтобы минимизировать потери нынешнего очагов в разных плоскостях, в ядрах. При анализе отдельных плоскостей deconvoluted и сложены для получения максимальной проецируемого изображения, чтобы минимизировать перекрытие очагов (Топ-хэт применения фильтра).
2. Метаморф (Molecular Devices, США) была использована для анализа числа очагов.
   Программа quantitates числа очагов в каждой ячейке после порог был применен для исключения фона. Информация заносится в электронные таблицы Microsoft Excel для дальнейшего анализа.

Рисунок 1. Иммунофлуоресценции визуализации γH2AX очагов (зеленый) в необработанном кератиноциты человека и в клетках, облученных 2 Гр и инкубировали еще в течение 1 часа при температуре 37 ° C, 5% СО _2. ДНК окрашивали TOPRO-3 (синий). Изображения были получены с помощью Zeiss LSM 510 Мета конфокальной микроскопии. Bar = 10 мкм.

e_content ">
Рисунок 2. Иммунофлуоресценции визуализации γH2AX очагов (зеленый) в человеческих кератиноцитов и в клетках, облученных 2 Гр и инкубировали еще в течение 1 часа при температуре 37 ° C, 5% СО _2. Изображения были получены с помощью Zeiss LSM 510 Мета конфокальной микроскопии используют 0,5 мкм Z-срезов (1-9), чтобы убедиться, что все очаги были приобретены. Изображений было потом укладывали для количественного использования Метаморф. ДНК окрашивали TOPRO-3 (синий). Сложены γH2AX и синие изображения были сложены для визуализации. Bar = 10 мкм.

Обсуждение

После воздействия ионизирующего излучения (γ-лучи), γH2AX очагов форме быстро и очагов номера достигают максимума между 30-60 минут ^2. Таким образом, наша 1 час после облучения момент времени отражает начальное образование DSB. Мы использовали клинически значимые дозы облучения 2 Гр для ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)	Media	Invitrogen	17005042	Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE).
Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)	Chamber Slides	Nalge Nunc international	NUN154534
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
0.5% Trypsin-EDTA x10		Invitrogen	15400-054	Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	Refractive index of 1.42 at 20°C.
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Tissue Culture Dish (150x25mm)	Petridish	BD Biosciences	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices