כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

Summary

כימות של גדיל הדנ"א הכפול פסים באמצעות היווצרות γH2AX כסמן המולקולרית הפכה כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור כימות γH2AX מוקדים לאחר חשיפה לקרינה של תאים.

Abstract

גדיל הדנ"א הכפול הפסקות (DSBs), אשר המושרה על ידי או תהליכים מטבוליים אנדוגני או על ידי מקורות חיצוניים, הם אחד נגעים DNA הקריטי ביותר מבחינת הישרדות ושמירה על שלמות הגנומי. תגובה מוקדמת לזירוז של DSBs הוא זירחון של הגרסה H2A היסטון, H2AX, על שאריות סרין-139, את מוטיב שמור ביותר SQEY בטרמינל C-, להרכיב γH2AX

Protocol

תא הכנה

1. קרטינוציטים האדם (FEP-1811) גדלו בינוני keratinocyte-סרום חינם (K-SFM; Invitrogen) בתוספת גורם הגדילה באפידרמיס, תמצית בלוטת יותרת המוח שור ו 20 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין, בשעה 37 ° C ו 5% CO _2.
2. ההשעיה תא בודד הוכן על ידי ניתוק עם טריפסין-EDTA (0.05% v / v)
3. תאים היו זורעים ב 8-Tek גם מעבדה שקופיות II microchamber (10,000 תאים / טוב) ושקופיות הודגרו במשך 3 ימים ב 37 ° C ו 5% CO _2.

הקרנה

1. תאים היו מוקרן על הקרח עם 2 Gy באמצעות מקור ¹³⁷ Cs (Gammacell 1000 irradiator עלית; Nordion הבינלאומי, קנדה, 20.6 שניות / Gy)
2. השליטה Unirradiated ו 2 Gy תאים מוקרן הודגרו במשך שעה 1 ב 37 ° C ו 5% CO _2.

Immunofluorescence מכתים

1. מדיה הדליפו את ותאי נשטפו עם 300μl של PBS (w / o Ca ^{2 +} או ^{2 +} Mg) לכל היטב היו מסובבים על מערבל מסלולית במשך 5 דקות.
2. המאגר היה מוטה לסירוגין 100μl של 4% המוכן טרי (v / v) paraformaldehyde נוספה גם כל השקופיות הודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
   Incubations כל בוצעו שוקת מכתים humidified
3. תאים נשטפו אז עם PBS (w / o Ca ^{2 +} או Mg ^{2 +).} שקופיות הונחו בתוך צנצנת Coplin וסובב על מערבל מסלולית במשך 5 דקות. צעד זה לשטוף חזר על עצמו עוד פעמיים.
4. המאגר היה היטה את עודף ו PBS בעדינות מחק.
5. תאים היו permeabilized באמצעות 100 מ"ל טריטון X-100 (0.1% v / v) לכל היטב הדגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
6. תאים נשטפו עם PBS (w / o Ca ^{2 +} או Mg ^{2 +)} כמתואר שלבים 3 ו -4 לעיל.
7. ללא חלבון מסוים מחייב נסתם 100 מ"ל של BSA (1% v / v) לכל היטב הדגירה 20 דקות בטמפרטורת החדר.
8. BSA עודף היה מוטה לסירוגין 100μl של נוגדנים חד שבטיים העיקרי עכבר היסטון-H2AX אנטי phospho (מדולל 1:500, ב BSA 1%; Millipore), נוספה גם עבור כל הדגירה 1 שעה בטמפרטורת החדר.
9. תאים נשטפו עם PBS (w / o Ca ^{2 +} או Mg ^{2 +)} כמתואר שלבים 3 ו -4 לעיל מודגרות עם 100μl של נוגדנים משני (אלקסה פלואוריד 488 עיזים אנטי עכבר IgG מדולל 1:500, ב BSA 1% ; Invitrogen) לכל היטב במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. (נוגדן מדולל הוחזק בחושך לאורך ההליך)
10. תאים נשטפו עם PBS (w / o Ca ^{2 +} או Mg ^{2 +)} כמתואר שלבים 3 ו -4 לעיל. עם זאת, החשיפה לאור היה ממוזער שימוש בנייר.
11. Counterstaining גרעיני בוצעה עם 100 מ"ל TOPRO3 (מדולל 1:500; Invitrogen) לכל היטב הדגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר
12. תאים נשטפו עם PBS (w / o Ca ^{2 +} או Mg ^{2 +)} כמתואר בשלב 10 לעיל.
13. חדרי הוסרו בקפידה השקופיות, לחות עודפת נמחק ומחליק הורשו אוויר יבש.
14. טיפה אחת של זהב להאריך פתרון אנטי לדעוך (Invitrogen) התווספה לכל היטב שקופיות היו רכוב (22x50 מ"מ coverslip) וכל נוזל עודף מסביב לקצוות של שקופיות נמחק.
15. מגלשות הוחזקו בחושך במשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר לפני איטום עם לק.
16. השקופיות היו מאוחסנים לילה בשעה 4 ° C בחושך לפני ניתוח.

מיקרוסקופית / ניתוח

1. Zeiss LSM510 Meta Confocal Microscpe נהג לרכוש תמונות באמצעות תקן ה-GFP (עבור γH2AX - Alexa פלואוריד 488 עיזים אנטי עכבר IgG) ולייזרים אדום רחוק (עבור TOPRO-3). בדרך כלל, 63 x טבילה שמן העדשה משמש מטרה.
   תמונות נרכשים דפוס Z-סדרה עם גודל צעד של 0.5 מיקרומטר. גודל הצעד של 0.5 מיקרומטר נבחרה כדי להקטין את איבוד של ההווה מוקדים במטוסים שונים הגרעינים. במהלך הניתוח, מטוסים בודדים deconvoluted וערמה לייצר תמונה מוקרנת מרבי כדי לצמצם את החפיפה של מוקדים (Top-כובע מסנן מוחל).
2. Metamorph (התקנים מולקולריים, ארה"ב) שימש לנתח מספר מוקדים.
   התוכנית quantitates מספר מוקדים בכל תא אחרי סף הוחל לכלול רקע. המידע נרשם גיליון אלקטרוני של Microsoft Excel לניתוח נוסף.

באיור 1. להדמיה immunofluorescence של γH2AX מוקדים (ירוק) ב קרטינוציטים האנושי בתאים שלא טופלו ו מוקרן עם 2 Gy וטופחו שעה נוספת בבית 1 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. ה-DNA היה מוכתם TOPRO-3 (כחול). תמונות נרכשו באמצעות LSM Zeiss 510 מיקרוסקופ Meta Confocal. בר = 10 מיקרומטר.

e_content ">
איור 2. להדמיה immunofluorescence של γH2AX מוקדים (ירוק) ב קרטינוציטים האנושי בתאים מוקרן עם 2 Gy וטופחו שעה נוספת בבית 1 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. תמונות נרכשו באמצעות LSM Zeiss 510 מיקרוסקופ Confocal באמצעות Meta 0.5 מיקרומטר Z-חתך (1-9) כדי להבטיח את כל מוקדי נרכשו. התמונות נערם ואז quantitation באמצעות Metamorph. ה-DNA היה מוכתם TOPRO-3 (כחול). ΓH2AX מוערמים ותמונות כחול נערמו להדמיה. בר = 10 מיקרומטר.

Discussion

בעקבות חשיפה לקרינה מייננת (קרני ה-γ), γH2AX טופס מוקדים במהירות ומספרי מוקדים להגיע למקסימום בין 30-60 דקות ^2. לכן, 1 שלנו שלאחר הקרנת שעה נקודת זמן משקפת הראשונית היווצרות DSB. השתמשנו הקרינה רלוונטיות קלינית של 2 Gy לצורך הניסוי שלנו. עם זאת, השיטה ניתן להשתמש במינון קר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)	Media	Invitrogen	17005042	Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE).
Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)	Chamber Slides	Nalge Nunc international	NUN154534
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
0.5% Trypsin-EDTA x10		Invitrogen	15400-054	Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	Refractive index of 1.42 at 20°C.
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Tissue Culture Dish (150x25mm)	Petridish	BD Biosciences	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices