La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante

Resumen

La cuantificación de ADN de doble filamento con la formación de estrías γH2AX como un marcador molecular se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología de la radiación. Aquí se demuestra el uso de un ensayo de inmunofluorescencia para la cuantificación de γH2AX focos después de la exposición de las células a la radiación.

Resumen

ADN de doble filamento se rompe (DSBs), que son inducidas por cualquiera de los procesos metabólicos endógenos o por causas exógenas, son una de las lesiones del ADN más críticos con respecto a la supervivencia y la preservación de la integridad genómica. Una primera respuesta a la inducción de DSBs es la fosforilación de la variante de la histona H2A, H2AX, en la serina-139 de residuos, en el altamente conservadas C-terminal motivo SQEY, formando γH2AX

Protocolo

Preparación de células

1. Queratinocitos humanos (FEP-1811) se cultivaron en los queratinocitos-Serum medio libre (K-SFM, Invitrogen) suplementado con factor de crecimiento epidérmico, el extracto de pituitaria bovina y 20 mg / ml de gentamicina, a 37 ° C y CO ₂ al 5%.
2. Una suspensión de células individuales ha sido preparado por separar con tripsina-EDTA (0,05% v / v)
3. Las células fueron sembradas en 8 y Laboratorio de diapositivas Tek II microcámara (10.000 células / pocillo) y las diapositivas se incubaron durante 3 días a 37 º C y 5% CO _2.

Irradiación

1. Las células fueron irradiados en el hielo con 2 Gy utilizando una fuente de ¹³⁷ Cs (Gammacell 1000 irradiador Elite; Nordion Internacional, ON, Canadá; 20,6 segundos / Gy)
2. El control no irradiado y 2 Gy células irradiadas se incubaron durante 1 hora a 37 ° C y 5% CO _2.

La tinción de inmunofluorescencia

1. Los medios de comunicación fue avisado y se lavaron las células con 300μl de PBS (w / o Ca ^{2 +} o Mg ^{2 +)} por pozo y se gira en un mezclador orbital durante 5 minutos.
2. El buffer fue advertido y 100μl de recién preparada 4% (v / v) paraformaldehído se añadió a cada pocillo y las diapositivas se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos.
   Todas las incubaciones se realizaron en un canal de tinción humidificado
3. Las células fueron lavadas con PBS (w / o Ca ^{2 +} o Mg ^{2 +).} Las láminas fueron colocadas en un frasco de Coplin y se gira en un mezclador orbital durante 5 minutos. Esta etapa de lavado se repitió otras dos veces.
4. El buffer fue advertido y el exceso de PBS fue borrada suavemente.
5. Las células fueron permeabilized con 100 ml de Triton X-100 (0,1% v / v) por pozo y una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente.
6. Las células fueron lavadas con PBS (w / o Ca ^{2 +} o Mg ^{2 +)} como se describe en los pasos 3 y 4 anteriores.
7. La unión no específica de proteínas fue bloqueado con 100 ml de BSA (1% v / v) por pozo y 20 minutos de incubación a temperatura ambiente.
8. El exceso de BSA fue advertido y 100μl de la principal del ratón monoclonal anti-fosfo-histona H2AX de anticuerpos (diluido 1:500, en el 1% de BSA, Millipore), se añadió a cada pocillo de una incubación de 1 hora a temperatura ambiente.
9. Las células fueron lavadas con PBS (w / o Ca ^{2 +} o Mg ^{2 +)} como se describe en los pasos 3 y 4 y se incubaron con 100μl del anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG diluido 1:500, en el 1% de BSA ; Invitrogen) por pocillo durante 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. (Anticuerpo diluido se mantuvo en la oscuridad durante todo el procedimiento)
10. Las células fueron lavadas con PBS (w / o Ca ^{2 +} o Mg ^{2 +)} como se describe en los pasos 3 y 4 anteriores. Sin embargo, la exposición a la luz se redujo al mínimo el uso de aluminio.
11. Contratinción nuclear se realizó con 100 ml TOPRO3 (diluido 1:500; Invitrogen) por pozo y una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente
12. Las células fueron lavadas con PBS (w / o Ca ^{2 +} o Mg ^{2 +)} como se describe en el paso 10.
13. Las cámaras fueron cuidadosamente removidos de las diapositivas, el exceso de humedad se borró y las diapositivas se deja secar al aire.
14. Una gota de prolongar GOLD anti-fade solución (Invitrogen) se añadió por pocillo y diapositivas montadas fueron (22x50 mm cubreobjetos) y el exceso de líquido alrededor de los bordes de la diapositiva se borró.
15. Las diapositivas fueron mantenidos en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de sellar con esmalte de uñas.
16. Las diapositivas fueron almacenados durante la noche a 4 ° C en la oscuridad, antes del análisis.

Microscopía / Análisis

1. Zeiss LSM510 Meta Confocal Microscpe utiliza para adquirir imágenes con la GFP estándar (por γH2AX - Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de ratón) y el láser rojo lejano (por TOPRO-3). Típicamente, un aceite de 63 x lente objetivo de inmersión se usa.
   Las imágenes se adquieren en un modelo de la serie Z con un tamaño de paso de 0,5 micras. Un tamaño de paso de 0.5 micras fue elegida para minimizar la pérdida de los actuales focos en diferentes planos en los núcleos. Durante el análisis, los planos individuales son deconvoluted y apilados para producir una imagen proyectada máxima para minimizar la superposición de los focos (Top-hat filtro aplicado).
2. Metamorph (Molecular Devices, EE.UU.) se utilizó para analizar el número de focos.
   El programa cuantifica el número de focos en cada celda después de que el umbral se ha aplicado para excluir a fondo. La información se registra en una hoja de cálculo Microsoft Excel para su posterior análisis.

Figura 1. Visualización de inmunofluorescencia γH2AX focos (verde) en queratinocitos humanos no tratados y en las células irradiadas con 2 Gy y se incubó durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO _2. ADN fue manchado con TOPRO-3 (azul). Las imágenes fueron adquiridas con un Zeiss LSM 510 microscopio confocal Meta. Bar = 10 micras.

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Figura 2. Inmunofluorescencia visualización de γH2AX focos (verde) en los queratinocitos humanos y en células irradiadas con 2 Gy y se incubó durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO _2. Las imágenes fueron adquiridas con un Zeiss LSM 510 microscopio confocal Meta con 0,5 micras Z-corte (1-9) para asegurar que todos los focos se han desarrollado. Las imágenes se apilan entonces para la cuantificación utilizando Metamorph. ADN fue manchado con TOPRO-3 (azul). El γH2AX apilados y las imágenes fueron apilados azul para la visualización. Bar = 10 micras.

Discusión

Después de la exposición a la radiación ionizante (rayos γ), γH2AX forma rápida los focos y los números de focos de alcanzar un máximo entre los 30-60 minutos ^2. Por lo tanto, nuestra una hora después de la irradiación punto del tiempo refleja la formación inicial del OSD. Hemos utilizado la dosis de radiación clínicamente relevante de 2 Gy para nuestro experimento. Sin embargo, el método puede ser utilizado para la dosis de radiación hasta 4 Gy para la detección de la formación inicial del O...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)	Media	Invitrogen	17005042	Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE).
Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)	Chamber Slides	Nalge Nunc international	NUN154534
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
0.5% Trypsin-EDTA x10		Invitrogen	15400-054	Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	Refractive index of 1.42 at 20°C.
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Tissue Culture Dish (150x25mm)	Petridish	BD Biosciences	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices