评价以下电离辐射的空间分布的γH2AX

摘要

微观分析γH2AX灶，形成以下丝氨酸139磷酸化H2AX在DNA双链断裂，已成为辐射生物学中的一个非常宝贵的工具。在这里，我们使用一种抗体，单甲基化的组蛋白H3赖氨酸4作为一个积极抄写常染色质的表观遗传标记，以评估辐射诱导γH2AX形成的细胞核内的空间分布。

摘要

早期的分子反应，DNA双链断裂（DSB的）磷酸化的SER - 139内的组蛋白^H2AX 1,2终端SQEY图案的残留。 H2AX的磷酸化介导的磷脂，inosito 3 -激酶（PI3K）的蛋白质家族，共济失调毛细血管扩张症（ATM）的突变，DNA -蛋白激酶催化亚基，ATM和相关RAD3（ATR）的^3。 H2AX的磷酸化形式，简称为γH2AX，蔓延到邻近地区的染色质的DSB网站，形成离散灶，很容易由³ immunofluorecence显微镜可视化。分析和定量γH2AX灶已被广泛用于评估DSB的形成和修复，特别是在电离辐射和评估各种修改化合物和细胞毒素化合物⁴辐射的功效， 。

鉴于这种双链断裂从头标志的精美的特异性和灵敏度，它在染色质中的DNA损伤和修复的过程提供新的见解。例如，在辐射生物学中心的范例是核DNA与放射敏感性的关键目标。事实上，在该领域的普遍共识在很大程度上被认为染色均匀的模板为DNA损伤与修复。然而，与γH2AX作为分子标记，DNA双链断裂，在γ射线照射，诱导γH2AX灶在常染色质和异染色质的形成悬殊的使用已^被观察到5-7。最近，我们使用的抗体面板，无论是单，双或三甲基化组蛋白H3赖氨酸9（H3K9me1，H3K9me2，H3K9me3）后生印记构异染色质和转录沉默和赖氨酸4（H3K4me1，H3K4me2，H3K4me3 ），这是密切相关的积极抄写常染色质区域，调查γH2AX的空间分布， ^电离辐射8。按照当时的想法，关于染色质生物学，我们的研究结果表明γH2AX的形成和^活跃转录9之间的密切相关。在这里，我们展示了非贴壁细胞中γH2AX灶的检测和定量的免疫方法，特别注重与其他的表观遗传标记，图像分析和三维建模与合作本地化。

研究方案

细胞制备

1. 人红白血病K562细胞生长在10％（V / V）饱和湿度5％的CO ₂环境中的胎牛血清和20毫克/毫升的庆大霉素的RPMI - 1640补充介质在37 ° C。
2. 染色前约18小时，洗指数生长的细胞^{（5 ×} 10 5细胞/毫升是最优的）用磷酸盐缓冲液（PBS），悬浮在新媒体和返回到37 ° _C，5％的CO 2。
3. 两次用PBS离心洗涤细胞，在5分钟的转速约1500，并重新悬浮在新鲜的媒体。
4. 计数细胞并调整细胞密度约为5 × 10 ⁵细胞/ ml。

细胞可以算作一个自动化的方法（如过滤器的大小5至20微米之间的希森美康或库尔特计数器），或通过台盼蓝排除方法和血球。过量的细胞数（> 800细胞/厘米^2），可能会导致非均匀染色。

辐照和免疫荧光染色

1. cytospin剪辑，过滤器卡和幻灯片的组装与适当的标签。

当装配cytospin仪器，确保漏斗过滤卡孔重合。

2. 使细胞或γ-辐射或X射线（在这个例子中2Gy）。

为了防止在照射病灶的形成，为5至10分钟之前和期间照射细胞置于冰上。

以下照射细胞在37℃，5％的CO ₂所需的时间（峰γH2AX水平的30分钟至1小时，在这个例子中的1小时）。

3. 用冷PBS清洗细胞两次离心悬浮在新鲜PBS。
4. 在5分钟500转100到150μL的细胞悬液，免除到每个cytospin漏斗和自旋。
5. 从cytospins分隔的幻灯片，让细胞适度空气干燥约15分钟。

不要让细胞完全干燥细胞形态可能瓦解。

6. 周围的细胞具有疏水笔绘制一个圆。
7. 4％多聚甲醛在室温（RT）5分钟，修复细胞。

根据我们的经验，与多聚甲醛固定是优于乙醇或甲醇固定。悬浮细胞需要固定在室温下5分钟，而贴壁细胞的最佳固定需要较长的固定时间（15至20分钟）。

我们发现，染色立即产生更好的效果，比储存在-20 ° C，通常在高背景荧光固定的幻灯片。

8. 用PBS清洗细胞两次，每次5分钟。
9. 通透细胞，用0.1％TRITON - X的RT 100 5分钟。

吐温80相比，我们通常观察与Triton X - 100通透细胞更好的信号。根据细胞类型，它可能需要改变的permeabilisation时间。例如，在K562细胞在室温下5分钟的通透性是足够的，而在15分钟的贴壁细胞通透需要。

10. 洗涤细胞用PBS三次，每次5分钟。
11. 座在室温为30分钟（3 × 10分钟）的1％BSA的细胞。

我们比较使用血清（二级抗体的同一品种产生）和牛血清白蛋白的PBS阻断效率。 BSA是在最大限度地减少非特异性二次抗体结合更有效率相比，血清。我们比较了不同的阻断时间，一夜之间堵在4 ° C相比，3 × 10分钟和3 × 20分钟的阻塞在室温下的步骤，并确定为3 × 10分钟的阻塞是最佳的。

12. 每张幻灯片添加50μL初级抗体（1：500 1％BSA稀释）。

孵育过夜抗体在室温为60分钟，结果减少背景染色的潜伏期比4 ° C。

13. 染色不同的标记，同时使用在不同的物种（如鼠抗γH2AX和兔抗在这个例子中的甲基化H3K4）提出的抗体。
14. 在室温为90分钟，在250 RPM摇摆平台上小学抗体孵育。

所有孵化加湿染色槽。

15. 洗涤细胞用PBS三次，每次5分钟。
16. 加入50μL（1：1000稀释在1％BSA）二级抗体，以每张幻灯片。

染色同一张幻灯片上的不同标记，使用二次抗体与Different种属特异性（抗体）和荧光发射波长（如抗鼠Alexa的488（绿色）和抗兔Alexa的- 546（红色）在这个例子中）。

17. 在室温为60分钟，在250 RPM摇摆平台上培养的细胞。

建议在黑暗潮湿的会议厅，避免褪色和干燥的二级抗体孵育的细胞。

18. 洗涤细胞用PBS三次，每次5分钟。
19. 每张幻灯片添加50μL（1:500 PBS稀释）TOPRO - 3。
20. 3X 5分钟，用PBS冲洗幻灯片。
21. 从幻灯片中删除多余的水分和添加防褪色的解决方案。

这是建议，没有完全晾干后方可加入防褪色的解决方案的细胞。

22. 盖玻片，指甲油密封和离开幻灯片在黑暗中过夜，在室温。

这是推荐使用的具体盖玻片焦＃1.5（0.16-19微米厚）和透明指甲油。

在幻灯片上放置盖玻片，应小心，以避免形成气泡。

图像采集

1. 蔡司LSM510元共聚焦显微镜是用来获取图像，使用标准GFP（绿色，488纳米），PI（红色543纳米）和远红光（蓝色633纳米）的激光。

图片收购，使用共聚焦显微镜，揭示了更好的空间分辨率。

由于γH2AX灶的大小可能会低于0.5μicrons，它是建议获得至少0.5μicron沿Z轴的步长大小的图像。

一个63 ×油浸物镜相比或高或低放大倍率是首选。对于成像许多灶计数细胞，最好是使用8个扫描速度和图像尺寸1024 × 1024像素。为了说明不同，它是建议使用2048 × 2048像素图像的大小为6扫描速度的核蛋白质的空间之间的关系。

当来自多个渠道的成像相比，一帧扫描线扫描收购建议。这就避免了漂白和更好的分辨率达到。顺序扫描是用来防止渠道之间的流血。

佛慈计数

图像分析和灶计数，可以使用各种套装软件（计有Metamorph，图像- J和Imaris）。这里描述灶使用Metamorph计数程序。

1. 无论是直接从文件菜单，或通过建立数堆栈选项打开γH2AX形象栈。
2. 转到进程“菜单，并选择堆栈算术。
3. 选择了最大的投影，选择要包含的飞机，并单击“确定”。
4. 保存作为γH2AXTIFF图像。文件，并打开TOPRO - 3（蓝色）的图像。
5. 进入的地区，选择一个区域的绘图工具画原子核周围的地区。
6. γH2AXTIFF图像处理菜单，并选择形态滤波器。
7. 选择顶帽子，并选择γH2AX图像作为源图像。
8. 应用自顶帽子过滤器和由此产生的图像将是一个二进制图像灶强度，低噪音和减少变异。

顶帽子值时，应注意选择。最优值，可以得到图像的视觉对比前后应用过滤器。

9. 前往处理菜单，并选择阈值图像。
10. 选择包容性阈值和选择较低和较高的阈值。

它通常是影响癌灶数目的阈值。因此，选择阈值时，需要十分重视。这可以最好地实现计数灶使用不同的阈值值在细胞暴露于γ辐射低于2 Gy的，然后比较与人工计数（眼），疫源地号码。最优阈值是一个最小化背景的包容性和最大限度地提高列入灶。

11. 选择TOPRO - 3的形象和地区菜单，并选择转移地区选项。选择TOPRPO - 3的源图像和顶帽子的目标，并单击确定。
12. 一旦核地区转移到了顶帽子的形象去测量菜单，并选择综合形态计量学分析。
13. 在弹出窗口中选择源图像顶帽子和按面积的措施。
14. 选择测量上衡量各地区，各获得所有相应的核顶帽子的形象灶数量。
15. 疫源地从每个区域的数字可以被导出到一个MS - Excel文件，使用日志数据的选项。

3D图像重建

要创建一个三维图像，从使用Metamorph栈：

1. 转到堆栈菜单选择三维重建。
2. 选择旋转的角度（如160 °，320 °）。
3. 选择类型最大的三维重建。
4. 选择旋转平面（水平或垂直）。
5. 选择的Z -校准距离。

最好是使用用户指定的Z轴的距离（最佳为0.5μicrons）。

6. 选择确定以创建一个三维重建。

线扫描分析

对于线扫描分析，使用Metamorph：

1. 打开一个单一的平面图像或堆放文件。
2. 转到测量工具栏“命令，选择线扫描分​​析。
3. 整个单元格中画一条线，这将自动显示每个标记的荧光强度和距离沿行的路径。

为了澄清各种染色标记的空间关系，例如，γH2AX灶和组蛋白甲基化，这是可取的画线，跨越地区，都是密集的差，在这些标记。

具有代表性的数据

对于这个演示的目的，我们利用抗体来γH2AX灶和H3K4me，双链断裂的空间分布来评价一个积极抄写常染色质的表观因素。如图1所示，与2Gy照射后γH2AX灶形成，主要为H3K4me染色和DNA染色TOPRO - 3（鲜艳染色的DNA区域指示异）沉闷的地区。

图1。γH2AX灶形式在常染色质主要在电离辐射。 （一）人红白血病K562细胞的免疫可视化γH2AX灶（绿色），1小时后，γ射线照射（2戈瑞）。 γH2AX灶有关H3K4me，代表积极抄写常染色质（红色）。 DNA标记TOPRO - 3（蓝色）。合并后的图像（蓝色，红色和绿色）演示了从排斥异色地区γH2AX灶。线扫描分析（荧光强度与距离）表示在一个平面上的标记相对分布。 （二）在不同的飞机从合并后的图像三维重建片上面所述。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Growth medium	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid
Fetal Bovine Serum (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma-Aldrich	T6146	Used to distinguish between live and dead cells.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
HistoneH3 (Mono-methyl K4)	Primary Antibody	Abcam	AB8895
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.
Polylysine slides		Menzel-Glaser
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Shandon Cytospin 4		Thermo Fisher Scientific, Inc.
Cytofunnels		Shandon, Inc.
Filter Cards		Shandon, Inc.	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Inc.	008877
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope			Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices