Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

Özet

DNA çift iplikli tatili yanıt Ser-139 H2AX fosforilasyon aşağıdaki formu γH2AX odakları, mikroskobik analiz radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada çekirdeğin içinde radyasyona bağlı γH2AX oluşumu uzamsal dağılımını değerlendirmek için, aktif transkripsiyonu ökromatin bir epigenetik işaretleyici olarak mono-metil histon H3 lizin 4 antikor kullanılır.

Özet

Histon H2AX ^1,2 terminal SQEY motifi içinde Ser-139 kalıntı DNA çift iplikli sonları (DSBs) bir erken moleküler yanıt fosforilasyon. H2AX Bu fosforilasyon fosfatidil-inosito 3-kinaz (PI3K) proteinleri aile, ataksi telenjiektazi mutasyona uğramış (ATM), DNA-protein kinaz katalitik subunit ve ATM ve RAD3 ilgili (ATR) ³ aracılı. ΓH2AX olarak anılacaktır H2AX fosforile formu, immunofluorecence mikroskopi ³ kolayca görselleştirildiği ayrık odaklar, şekillendirme, DSB sitesinden kromatin komşu bölgelere yayılıyor. ΓH2AX odakları Analizi ve kantitatif DSB oluşumu ve onarım, özellikle iyonlaştırıcı radyasyon yanıt ve bileşikleri ve sitotoksik bileşikler ⁴ değiştirerek çeşitli radyasyon etkinliğini değerlendirmek için yaygın olarak değerlendirmek için kullanılır olmuştur.

DSBs bu de novo marker zarif özgüllük ve duyarlılık göz önüne alındığında, kromatin bağlamında DNA hasarı ve onarım süreçleri içine yeni anlayışlar sağladı. Örneğin, radyasyon biyolojisi merkezi paradigma nükleer DNA radyasyon hassasiyeti açısından kritik bir hedef olmasıdır. Gerçekten de, bu alanda genel bir fikir birliği, homojen bir şablon olarak DNA hasarı ve onarımı için kromatin görünüm için büyük ölçüde olmuştur. Ancak, DSBs moleküler marker ökromatin ve heterokromatin γ-ışınlama indüklenen γH2AX odaklarının oluşumu bir eşitsizlik olarak γH2AX kullanımı ile ^5-7 görülmüştür. Son zamanlarda, biz antikorların bir panel ya da mono-, di-kurucu heterokromatin ve transkripsiyonel susturulması ve lizin 4 epigenetik diziniz (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 veya lisin 9 tri-metil histon H3 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) ), sıkıca iyonlaştırıcı radyasyon ⁸ γH2AX uzamsal dağılımını araştırmak euchromatic bölgelerde aktif transkripsiyon ilişkili olduğu. Kromatin biyolojisi ile ilgili hakim fikirleri doğrultusunda, bizim bulgular γH2AX oluşumu ve aktif transkripsiyon ⁹ arasında yakın bir ilişki göstermiştir. Burada diğer epigenetik belirteçler, görüntü analizi ve 3D modelleme ile co-lokalizasyon belirli bir odak, yapışmaz hücreleri γH2AX odaklarının tespiti ve kantitatif için immünofloresan yöntemi göstermek.

Protokol

Hücre hazırlık

1. İnsan erythroleukemic K562 hücreleri 37 nemlendirilmiş bir% 5 CO ₂ ortamında% 10 (v / v) fetal sığır serumu ve 20 mg / ml gentamisin ile desteklenmiş RPMI-1640 ortamı ° C yetiştirilen
2. Boyamadan önce yaklaşık 18 saat, 37 taze medya ve karşılığında tekrar süspansiyon salin (PBS), tamponlu fosfat ile katlanarak büyüyor hücreleri (5 x ¹⁰ 5 hücre / ml) optimum yıkama ° C,% 5 _CO 2 .
3. 5 dakika boyunca yaklaşık 1500 rpm'de santrifüj yoluyla hücreler iki kez PBS ile yıkayın ve taze medya içinde tekrar süspansiyon haline getirin.
4. Hücre sayımı ve hücre yoğunluğu yaklaşık 5 x 10 ⁵ hücre / ml ayarlayabilirsiniz.

Hücreler otomatik bir yöntem (örneğin Sysmex veya 5 ila 20 mikron arasında filtre boyutu ile Coulter sayacı) veya trypan mavisiyle boyama metodu ve bir haemocytometer kullanarak ya sayılabilir. Aşırı hücre sayısı (> 800 hücre / cm ^2), homojen olmayan boyama yol açabilir .

Işınlama ve immünofloresan boyama

1. Sitospin klipleri, filtre kartları ve slaytlar uygun etiketleme ile birleştirin.

Montaj sitospin cihazları filtre kartı delik huni çakışacak şekilde sağlamak.

2. Γ-radyasyon veya X-ışınları (bu örnekte 2Gy) hücreleri Açığa.

Işınlama sırasında odaklarının oluşumunu önlemek için, önce ve radyoterapi sırasında 5 ila 10 dakika buz üzerinde hücrelerin tutun.

Irradyasyonu takiben 37 hücreleri inkübe ° C,% 5 CO ₂ için gereken zaman (pik γH2AX seviyeleri 30 dakikadan 1 saate kadar kadar; Bu örnekte 1 saat) .

3. Soğuk PBS ile iki kez, taze PBS içinde santrifüj ve tekrar süspansiyon hücreleri yıkayın.
4. 500 rpm'de 5 dakika boyunca her sitospin huni ve spin hücre süspansiyonu 100 ile 150 mcL dağıtın.
5. Cytospins slaytlar ayrı ve hücreler yaklaşık 15 dakika orta derecede kuru hava sağlar.

Hücresel morfoloji parçalanır, hücreler tamamen kurumasını izin vermeyin.

6. Hidrofobik bir kalem ile hücrelerin etrafında bir daire çizin.
7. Hücreler az 5 dakika oda sıcaklığında (RT) için% 4 paraformaldehid ile sabitleyin.

Deneyimlerimiz, paraformaldehid ile tespit etanol veya metanol ile tespit üstündür. Uzun fiksasyon kez (15 ila 20 dakika) yapışık hücrelere Optimum sabitleme için gerekli olan ise süspansiyon hücrelere RT az 5 dakika fiksasyon gerektirir.

Biz bu boyama hemen genellikle yüksek eşiğe sonuçları -20 ° C sabit slaytlarını depolamak daha iyi sonuçlar veren bulabilirsiniz.

8. Her biri için 5 dakika hücreler PBS ile iki kez yıkayın.
9. % 0.1 5 dakika RT Triton-X 100 hücreleri Permeabilize.

Tween-80 ile karşılaştırıldığında genellikle Triton-X 100 ile permeabilize hücrelerin daha iyi sinyaller gözlemliyoruz. Hücre tipine bağlı olarak permeabilisation saatini değiştirmek için gerekli olabilir. Örneğin 15 dakikalık bir permeabilization yapışık hücrelere gerekli ise, K562 hücrelerinde permeabilization RT az 5 dakika yeterli.

10. Her biri için 5 dakika hücreler PBS ile üç kez yıkayın.
11. RT 30 dakika (3 x 10 dakika)% 1 BSA hücrelerin engelleyin.

Biz engelleme verimliliği serum (sekonder antikor olarak aynı türün türetilmiştir) ve PBS sığır serum albumin kullanılarak karşılaştırıldı. BSA serum göre sekonder antikor non-spesifik bağlanma en aza indirerek daha verimli oldu. Biz bir gecede 4 engelleme, farklı engelleme kez karşılaştırıldığında ° C 3 x 10 dakika ve 3 x 20 dakika oda sıcaklığında engelleme adımları ve 3 x 10 dakika süreyle bloke en uygun olduğu belirlenir.

12. Her bir slayt: 50 mcL primer antikor (500% 1'lik BSA ile seyreltilmiş 1) ekleyin.

Bir gecelik inkübasyon kıyasla azaltılmış arka plan boyama 60 dakika sonuçlar için RT primer antikor ile Kuluçka 4 ° C

13. Aynı anda farklı türleri (örneğin, bu örnekte, fare ve tavşan anti-γH2AX anti-metil H3K4) yükseltilmiş antikorları farklı belirleyicileri leke kullanın.
14. 90 dakika için 250 rpm'de sallanan platform üzerinde RT primer antikorlar ile inkübe edin.

Tüm inkubasyon nemlendirilmiş bir boyama çukurda yapılır.

15. Her biri için 5 dakika hücreler PBS ile üç kez yıkayın.
16. 50 mcL ekleyin (1: 1000% 1'lik BSA ile seyreltilmiş) ikincil antikor her slayt.

D ile aynı slayt üzerinde farklı belirteçleri leke sekonder antikorlarifferent türlere göre (primer antikor göre) ve floresan emisyon dalga boyu (örneğin anti-fare Alexa 488 (yeşil) ve bu örnekte anti-tavşan Alexa-546 (kırmızı)).

17. Hücreleri, 250 rpm'de sallanan platform üzerinde RT 60 dakika inkübe edin.

Solma ve ikincil antikor kurumasını önlemek için bir karanlık nemli odasında hücreleri inkübe tavsiye edilir.

18. Her biri için 5 dakika hücreler PBS ile üç kez yıkayın.
19. Her bir slayt (PBS içinde seyreltilmesi 1:500) TOPRO-3 50 mcL ekleyin.
20. 3X 5 dakika PBS ile slaytlar yıkayın.
21. Slaytlar aşırı neme kaldırın ve anti-solmaya çözüm ekleyin.

Bu hücreler tamamen anti-solmaya çözüm eklemeden önce kuruması için tavsiye edilir.

22. Lamel, tırnak cilası mühür ve oda sıcaklığında karanlık bir gecede slayt terk.

Konfokal özel lamelleri # 1.5 (0,16-19 mikron kalınlığında) ve net oje kullanmanız tavsiye edilir.

Slayt lamel yerleştirerek, bakım, hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için alınmalıdır.

Görüntü elde etme

1. A Zeiss LSM510 Meta Konfokal Mikroskop standart GFP (yeşil, 488 nm), PI (kırmızı 543 nm) ve çok kırmızı (mavi 633 nm) lazerler kullanarak görüntüleri elde etmek için kullanılır.

Görüntüler mekansal çözünürlükte daha iyi ortaya bir konfokal mikroskop kullanılarak elde etti.

ΓH2AX odaklarının boyutu 0.5 μicrons daha düşük olabilir, Z-ekseni boyunca en az bir 0.5 μicron adım boyutu ile görüntüler elde etmek için tavsiye edilir.

63 x immersiyon yağı objektif lens daha yüksek veya daha düşük bir büyütme göre tercih edilir. Sayma odakları için görüntüleme birçok hücre için bir tarama hızı ve 1024 x 1024 piksel görüntü boyutu 8 kullanmak için tercih edilir. 6 kişilik bir tarama hızı 2048 x 2048 piksel görüntü boyutu ile kullanılması tavsiye edilir farklı nükleer proteinler arasındaki mekansal ilişkiyi göstermek için.

Birden fazla kanal görüntüleme line-scan satın alma, bir çerçeve tarama göre tavsiye edilir. Bu beyazlatma önler ve daha iyi çözünürlük elde edilir. Sıralı tarama yoluyla kanallar arasında kanama önlemek için kullanılır.

Odaklar sayım

Görüntü analizi ve odaklar sayma, çeşitli yazılım paketleri (Metamorph, Resim-J ve Imaris inlcuding) kullanılarak yapılabilir. Metamorph kullanarak odakları sayma için prosedürü burada açıklanmıştır.

1. Dosya menüsünde doğrudan veya yapı numarası yığınlarının seçeneğini kullanarak açın γH2AX görüntü yığınları.
2. Süreç menüsüne gidin ve yığın aritmetik seçti.
3. Maksimum projeksiyon seçti ve dahil edilecek uçakların seçin ve Tamam'ı tıklatın.
4. ΓH2AX Tiff olarak ortaya çıkan görüntü kaydetme. TOPRO-3 (mavi), resim dosyası ve açın.
5. Bölgelere gidin ve bir bölge çizim aracı seçin ve çekirdekleri etrafında bölgelerde çizin.
6. ΓH2AX Tiff resmin üzerine tıklayın ve süreç menüsüne gidin ve morfolojik filtreler seçin.
7. Top-Hat seçti ve kaynak görüntü olarak γH2AX görüntü seçin.
8. Uygula Top-Hat filtresi ve sonuçta elde edilen görüntü odakları yoğunluğu daha az gürültü ve daha az varyasyon ile ikili bir görüntü olacak.

Top-Hat değerleri seçerken dikkatli olmalıdır. Optimal değerler filtreler uygulayarak önce ve sonra görüntüleri görsel karşılaştırılması ile elde edilebilir.

9. Süreci menüsüne gidin ve eşik görüntü seçin.
10. Dahil eşiği seçin ve alt ve üst eşik değerleri seçin.

Genellikle odakları sayısını etkiler eşik değerleri. Bu nedenle, eşik değerleri seçerken çok dikkat gereklidir. Bu en iyi 2 Gy γ-radyasyon daha düşük maruz kalan hücrelerde farklı eşik değerleri kullanarak sayma odaklar numarası elde etti ve daha sonra manuel sayma (göz) ile odaklar sayıları karşılaştırmak olabilir. Optimal eşik değeri, arka plan dahil en aza indirir ve odaklar dahil en üst düzeye çıkarır biridir.

11. TOPRO-3 görüntü seçin ve bölgeler menüsüne gidin ve transfer bölgelerde seçeneğini seçin. TOPRPO-3 kaynağı olarak görüntü ve Top-Hat gibi bir hedef seçin ve Tamam düğmesini tıklatın.
12. Bir kere nükleer bölgelerde önlem menüsüne gidin ve Entegre morfometrisi Analizi seçin Top-Hat görüntü aktarılır.
13. Alana göre pop-up pencere seçeneğini seçin kaynak görüntü-Top-Hat ve ölçü.
14. Bütün bölgeler ölçmek seçin ve önlem Top-Hat görüntü ilgili çekirdeğinin tüm odakları numarası almak için tıklayın.
15. Her bölgede odaklar numaraları günlük veri seçeneğini kullanarak bir MS-Excel dosyası içine ihraç edilebilir.

3Dgörüntüleri yeniden

Metamorph kullanarak yığından bir 3D görüntü oluşturmak için:

1. Yığını menüsüne gidin ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon seçin.
2. Dönme açısı (örneğin 160 °, 320 °) seçin.
3. 3D rekonstrüksiyon tip maksimum seçin.
4. Dönme düzlemi (yatay veya dikey) seçti.
5. Z-kalibrasyon mesafe seçti.

(Optimal 0,5 μicrons) Z mesafe belirtilen kullanıcı için tercih edilir.

6. 3D yeniden oluşturmak için Tamam'ı seçin.

Hat tarama analizi

Metamorph kullanarak hat tarama analizi için:

1. Tek bir düzlemde görüntü veya yığılmış bir dosya açın.
2. Ölçmek araç çubukları komutu gidin ve line-scan analizi seçin.
3. Hücre arasında bir çizgi çizin ve bu hattı, yol boyunca otomatik olarak her marker floresan ve mesafe ortaya koyacaktır.

Çeşitli kromatin belirteçlerin mekansal ilişki aydınlatmak için, örneğin, γH2AX odakları ve histon metilasyonu, bu belirteçler yoğun ve yoksul bölgelerde yayılan çizgiler çizmek için tercih edilir.

Temsilci Veri

Bu gösteri amaçla aktif ökromatin transkripsiyonu epigenetik belirleyici DSBs mekansal dağılımını değerlendirmek, γH2AX odakları ve H3K4me antikorlar kullanılır. 2Gy ile ışınlama aşağıdaki Şekil 1'de gösterildiği gibi, γH2AX odakları H3K4me hem boyama ve TOPRO-3 leke DNA (parlak boyanan DNA bölgeleri heterokromatin göstergesi) donuk olan bölgelerde ağırlıklı olarak kurdu.

Iyonlaştırıcı radyasyon yanıt ökromatin ağırlıklı olarak Şekil 1. γH2AX odakları formu. Insan erythroleukemic K562 hücrelerinde γH2AX odakları (yeşil) (A) İmmünofloresan görselleştirme, γ-ışınlama 1 saat sonra (2 Gy). γH2AX odakları aktif ökromatin (kırmızı) transkripsiyonu temsil eden, H3K4me ilgili gösterilmiştir. DNA TOPRO-3 (mavi) olarak etiketlenir. Birleştirilen görüntünün (mavi, kırmızı ve yeşil) heterokromatik bölgelerden dışlama γH2AX odakları göstermektedir. Line-scan analizi (floresan vs mesafe), tek bir düzlemde belirteçlerin göreceli bir dağılım gösterir. (B) Birleştirilen görüntünün 3 boyutlu rekonstrüksiyon farklı düzlemlerde Dilimleri yukarıda anlatılan.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Growth medium	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid
Fetal Bovine Serum (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma-Aldrich	T6146	Used to distinguish between live and dead cells.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
HistoneH3 (Mono-methyl K4)	Primary Antibody	Abcam	AB8895
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.
Polylysine slides		Menzel-Glaser
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Shandon Cytospin 4		Thermo Fisher Scientific, Inc.
Cytofunnels		Shandon, Inc.
Filter Cards		Shandon, Inc.	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Inc.	008877
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope			Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices