Microiontophoresis和显微操作的微循环活体荧光成像

摘要

Microiontophoresis需要在电势之间的内部和外界的微的差异，从一个微离子的运动。生物活性分子，从而交付的电流成比例。我们说明结合显微研究在微循环内皮依赖性血管舒张的乙酰胆碱microiontophoresis。

摘要

Microiontophoresis需要通过微管尖端的电流通过溶质在指定的网站内，提供一个实验的准备。 Microiontophoresis可以模拟提供到神经元再现²的神经递质和神经肽的突触传递^的 1 。可以忽略不计容积（液）的位移，避免了机械扰动的实验准备。改善微循环³适应这些技术，使血管扩张和血管收缩的机制，在微观层面，在 ^体内 4,5的研究。一个关键的优势是对等的本地化交付使血管舒缩研究没有唤起全身或自反血压和组织血流量的变化，从而揭示了内在属性的微血管内微血管网络的定义站点的反应。

的microiontophoresis限制，传递到感兴趣的网站的代理的精确浓度是^难以确定6。然而，其释放的微量提示是成正比的强度和持续时间的弹射目前^2,7，这样，重复性的刺激-反应关系可以很容易确定的实验条件下定义（如下所述） 。影响微电泳交付的其他因素包括其在溶液中的溶质浓度和电离。内部的微管尖端直径应〜1微米或更小，以尽量减少扩散的"漏"，可以用护电流抵消。因此，向外（正）目前用于弹出保留内微阳离子和负电流。

微量的制备是促进了先进的电子车夫。微量移液器含有灯丝，玻璃毛细管拉成的微尖的"芯"的解决方案，从后端（"回填"）填补。这样做是通过插入microcapillary管连接注射器的微腔的兴趣和退出的解决方案解决方案。 Micromanipulators启用所需的微量安置在实验的准备。可以放置一个可移动的基础上安装Micromanipulators各地的准备，根据地形的微血管网络（下文）。

本议定书演示到一个鼠标提睾肌准备的动脉（见相关的协议:朱庇特的ID＃2874），产生内皮依赖性血管舒张的乙酰胆碱^{microiontophoresis（乙酰}胆碱+ CL - ）。刺激同步交付使用电子触发与数字化图像采集。 Cx40 ^BAC - GCaMP2转基因小鼠⁹的使用，使细胞内钙离子反应，在生活改善微循环的底层在动脉内皮细胞的血管舒张的可视化。

研究方案

1。动物护理和使用

从体制上的动物护理和使用委员会的审查和批准后，至少12周龄雄性小鼠。鼠标是与戊巴比妥钠（60毫克/公斤）经腹腔（IP）注射麻醉。整个手术过程中和实验协议，麻醉维持补充剂（10-20％初始注射，IP）（每次30-60分钟;表示戒断反应到脚趾或尾巴捏）。实验过程完成后，鼠标过量巴比妥（IP）和颈椎脱位安乐死。

2。微量移液器和Microiontophoresis

1. 准备从高硼硅玻璃毛细管使用水平吸管拉马Microiontophoresis微量（内部尖端直径1微米）。我们有一个刚度〜5毫米锥度;不再锥更加灵活。
2. 微量移液器1M乙酰胆碱在18.2MΩ水溶解（Figure1A三）回填。进行回填，microcapillary管连接到0.2微米的过滤器加上一个注射器含利息激动剂（图1）。这些都可以随时编造（见下文），或从商业供应商购买。 microcapillary管插入后端的交付，同时撤回microcapillary管作为微管填充的微管和乙酰胆碱的解决办法是进入管腔。控股的微量用其尖端朝下，轻轻弹的微量气泡去除。
3. 微管是装在一个显微操纵器（图2）持有人担保。持有人有银线内的微连接的乙酰胆碱的解决方案，而这又是一个microiontophoresis程序员的正极连接到外部引脚。在组织编制的边缘安全的第二个银线连接到负极完成的电路是在准备到生理盐水先进的微尖。
4. 护电流应用，以防止血管扩张（或荧光反应）时，微管尖端的位置相邻的动脉壁。保留目前的微量提示（内部直径为1微米）和激动剂浓度的大小会有所不同，但定义的参数（我们使用1M乙酰胆碱，提示1微米〜200 nA的）的是高度重现。固定电流不再与目前通过电子触发图像采集发病同步（补充图1）弹射交付重合。

3。显微

1. 铁磁不锈钢编造出一个为XY显微镜阶段的自定义平台。平台尺寸（1 / 8"× 12"× 13"），使有足够的空间，周围的磁基地（图2B），使定位为准备决定担保的期望（图2A）。Micromanipulators实验准备的位置micromanipulators。直接放置在制造平台周围感兴趣的地点（图2C）定位微量准备。

4。代表性的成果

1. 随着微管尖端定位一个动脉旁，有荧光反应ACH（保留目前的调整，以防止乙酰胆碱泄漏）。低于阈值的刺激，有没有效果。然而，随着刺激强度的增加，内皮细胞钙荧光更远的距离，沿动脉逐步增加了，因为没有刺激的部位（图3）的荧光强度。

图1。进行回填Microiontophoresis移液器的方法 。 A）microcapillary管（绿色箭头）是固定在一个压缩接头连接到一个0.2微米的过滤器（紫色箭头），然后附加到1M乙酰胆碱填补了注射器（蓝色箭头），B）microcapillary管喂进流离失所microiontophoresis通过吸管后端和解决方案，以填补管腔内的微管，C），一旦移液器填满，保持尖向下，轻轻一抖锥度以上，以去除气泡（黑色箭头）。

图2。微操作机器人放置自定义平台。 A）铁磁性的不锈钢平台被放置在一个自定义MVX10显微镜含有一个XY平移阶段的基本二）圆形磁性底座的紧凑型3轴micromanipulators的底部贴三）围绕定位的实验准备Micromanipulators（见相关的协议:朱庇特ID＃2874）的研究感兴趣的特定网站。 "红外紧凑的尺寸和多功能性，可以同时使用多种微量。

图3。在小动脉钙的荧光 。衬里的小动脉壁的内皮细胞的钙荧光增加刺激的强度。前3板的荧光反应的图像）250 NA，B）500 NA和C）1000 nA的弹射电流（500毫秒脉冲持续时间）。内皮细胞钙荧光增加的距离是在AC（〜130℃，270和400微米，分别）括号内表示。参考线横跨在每个面板动脉表示荧光反应（F / FO），乙酰胆碱刺激的部位。 D）F / FO随时间增加乙酰胆碱刺激的录音。弹射电流的增加，F / FO增加幅度和持续时间。请注意，100 nA的刺激阈值以下，并没有影响。

补充图1。电子触发电路原理图。这种电路是从一台个人计算机的并行端口相连。激活时，它提供了一个恒定的5V TTL脉冲。 7805芯片是一个5V稳压器连接到一个9 - 12V直流电源（电池一个合适的电压是罚款）。从7805的输出功率四路双向开关电路的输出。 1K的电阻两端的输入是从计算机。

讨论

这里所描述的协议表明准备和实施microiontophoresis微量的方法。乙酰胆碱的交付是用来说明在麻醉小鼠的动脉钙信号基本内皮依赖性血管舒张功能。我们的结果表明，乙酰胆碱增加microiontophoresis微量电流（图3）弹射力度内皮细胞钙荧光增加距离。乙酰胆碱缺乏休息的条件下的荧光增加，表示可以忽略不计，从微渗漏。缺乏应对降至100 nA刺激的强度（图3，传说）说明，内皮细胞钙增加所需的刺激阈值强度。这些技术可以很容易地适应其他血管活性药物和组织准备。

实际考虑:microiontophoresis工作研究动脉反应，几件事情应该得到承认。虽然它已被证明难以确定实际交付激动剂浓度，刺激 - 反应曲线之内和之间的准备重现。这些都可以通过脉冲持续时间不变（例如，500毫秒）和不同的弹射电流（例如，250，500和1000 NA;图3）。此外，弹射目前可以保持不变（例如，500 NA）和脉冲持续时间不同（例如，250，500和1000毫秒）。对于定义的激动剂浓度的行动，准备可以灌流合适的解决方案^5。由于溶质的弹射动力，是电荷的运动，要交付的代理人必须携带的净电荷从微流离失所。为了确保代理人的利益是主要的电荷载体，它溶解在高浓度（例如，对乙酰胆碱的1男），以尽量减少电渗。当这需要操纵微量填充液的pH值，车辆的控制规定，以确定任何非特异性影响。适当的控制，也应单独通过的电流进行（例如，用充满生理盐水的微量）。代理其网站发布的扩散的有效距离应该是确定的，是最容易消失的一种生理反应（如血管扩张，或在细胞内钙离子的乙酰胆碱后弹射上升）由经验的微量定位于定义目标站点的距离。在实践中，有效扩散距离是很大的影响，如何定位在组织的微尖;例如，如果压入的组织和其尖端的技巧是闭塞，比弹射受损。过度的结缔组织是特别麻烦，应该从组织表面除去，在手术准备。也应注意给消耗的指定代理商的一角的可能性。这是尽量减少使用相对短的脉冲（例如，≤1秒）。持续电流（例如，几秒钟），激动剂可能被开除的提示更迅速地超过它可以从散装油中的微解决方案扩散所取代。

因为微不足道的体积是流离失所与microiontophoresis，如果之一是试图以改变的地方离子环境（例如，以提供一个极化K ⁺刺激），可以有效地实现与microiontophoresis但是很容易的压力散装液体所需的弹射实现组成。一个动脉的局部刺激，内部直径为2-3微米的微管提示的工作以及与弹射压力4-5磅（28-35千帕）和脉冲持续时间（如1秒）控制一个^电磁阀10。持续提供从微量到微血管代理是必需的，最好是使用适当的内部尖端直径（例如，〜10微米^）11,12微量压力弹射。静水列的已知与活塞阀的高度提供了一种廉价的，良好定义的恒定压头开/关。流速由枪头和驾驶压力内径。一如往常，车辆控制是必不可少的，以排除非特异性的压力弹射行动。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
使用材料	公司	目录编号	评论
硼硅玻璃毛细管	华纳仪器	GC120F - 10
卧式移液器拖轮	萨特仪器	模型P - 97
氯化乙酰胆碱	Sigma - Aldrich公司	A6625
露儿枢纽适配器	Martech	AC1343	为了确保microcapillary管
0.2微米尼龙泰坦过滤器	孙斯里兰卡	42204 - NN	低保留体积，以减少损失
5 ml注射器	流式细胞 - 迪金森公司	309603
移液器架	华纳仪器	E45W - M12VH
银线	华纳仪器	AG10W	0.25毫米直径
3轴显微	锡斯基尤设计仪器	DT3 - 100，MXB，MXC，MGB / 8	机械臂组件，如图所示
microiontophoresis当前的编程	世界精密仪器	型号260
触发装置	自定义	自定义	电路提供增刊。图1
不锈钢板	麦克马斯特 - 卡尔	1 / 8"× 12"× 12"	根据设计
强化数码相机	斯坦福大学光电公司	XR/Mega-10	派控制软件集成