微小循環の生体内蛍光イメージングのためのMicroiontophoresisとマイクロマニピュレーション

要約

Microiontophoresisは、マイクロピペットの内側と外側との間の電位の差に応答して、マイクロピペットからのイオンの動きを伴います。生物学的活性分子は、それによって電流に比例して配信されます。我々は、微小循環の内皮依存性血管拡張を研究するためにマイクロマニピュレーションと連携してアセチルコリンのmicroiontophoresisを示しています。

要約

Microiontophoresisは実験的な準備の中で指定されたサイトでの溶質を提供するためにマイクロピペット先端部を流れる電流の通過を伴います。 Microiontophoresisは再現性ニューロン^2の上に神経伝達物質および神経ペプチドを提供することにより、シナプス伝達^1をシミュレートすることができます。無視できる量は（流体）の変位は、実験的な準備に機械的な障害を回避することができます。微小循環³にこれらの技術を適応させる血管拡張と血管収縮のメカニズムをin vivoで ^4,5 の顕微鏡レベルで検討することが可能になりました。このような局所的輸送の主要な利点は、それによって血管の固有の特性を明らかに、血圧と組織の血流に全身または反射的な変更を想起させることなく、微小血管ネットワーク内で定義されているサイトで勉強する血管運動応答を可能にしています。

microiontophoresisの制限は、興味のあるサイトに配信エージェントの正確な濃度が^6を把握することが困難なことです。それにもかかわらず、マイクロピペットの先端からのリリースでは^、2,7現在の放出の強さと持続時間に比例する、ように再現性の刺激-反応関係は、容易に定義されている実験条件（後述）の下に決定することができます。 microiontophoretic配信に影響を及ぼすその他の要因は、溶質濃度と溶液中でのイオン化が含まれています。マイクロピペットの先端の内径は、保持電流を相殺することができます拡散"漏れ"を最小限に抑えるために、〜1μm以下にする必要があります。したがって、外側（正）現在は、マイクロピペット内に保持するために使用される陽イオンと負の電流を取り出すために使用されます。

マイクロピペットの作製は、洗練された電子車夫⁸で促進される。マイクロピペットは、バックエンド（"埋め戻す"）から充填マイクロピペットの先端に"芯"解決策そのフィラメントを含有するガラス毛細管から抜き出されます。これは、マイクロピペットの内腔に関心や取り出しソリューションのソリューションを含むシリンジに接続されているマイクロキャピラリーチューブを挿入することによって行われます。マニピュレーターは、実験準備中マイクロピペットの所望の配置を有効にしてください。可動ベースに搭載されたマイクロマニピュレータは、微小血管ネットワーク（以下開発）の地形に応じて準備の周りに配置することができます。

内皮依存性血管拡張を生成するために：（JoveのIDは＃2874に関連付けられたプロトコルを参照）マウスの精巣挙筋の準備の小動脈に^-現在のプロトコルは、アセチルコリン（ACH ⁺ Cl）のmicroiontophoresisを示しています。刺激の配信は電子トリガを使用してデジタル化された画像取得と同期しています。 CX40 ^BAC - GCaMP2トランスジェニックマウス⁹の使用は、生活の微小循環に細動脈内皮細胞の血管拡張の基盤となる細胞内カルシウム応答の可視化を可能にします。

プロトコル

1。動物のケアと使用

レビューと動物実験と使用委員会の承認に続いて、少なくとも12週齢の雄マウスが使用されます。マウスは、腹腔内（ip）注射を介してペントバルビタールナトリウム（60 mg / kg）で麻酔です。外科的処置および実験的なプロトコルを通じて、麻酔は必要に応じてサプリメント（最初の注射の10-20％は、ip）（;つま先や尾のピンチに撤退の反応によって示される毎に30〜60分）によって維持されています。実験手順の完了後にマウスはペントバルビタール（IP）と頚椎脱臼により安楽死と過剰投与されています。

2。マイクロピペットおよびMicroiontophoresis

1. Microiontophoresisのマイクロピペットは、（内部の先端の直径は、約1ミクロン）水平ピペットプラーを使用してホウケイ酸ガラス毛細管から調製される。私達のものは剛性のための〜5mmのテーパーを持って、長いテーパーはより柔軟です。
2. マイクロピペットは18.2MΩ水に溶解した1Mアセチルコリン（図1a - C）で充填されています。埋め戻しのために、マイクロキャピラリーチューブは、関心のアゴニスト（図1）を含む注射器に結合さ0.2μmのフィルターに接続されています。これらは容易に作製（下）または商用ベンダーから購入することができます。マイクロキャピラリーチューブは、マイクロピペットのバックエンドに挿入され、マイクロピペットがいっぱいになるにつれてマイクロキャピラリーチューブを引き出しながら、AChのソリューションは、内腔に配信されます。その先端が下向きにマイクロピペットを保持し、気泡が静かにマイクロピペットをフリックすることで削除されます。
3. マイクロピペット、マイクロマニピュレータ（図2）に取り付けられたホルダーに固定されています。ホルダーは、順番にmicroiontophoresisプログラマの正端子に接続された外部ピンにマイクロピペット内AChのソリューションを接続する銀線を持っています。組織調製の端に固定された第二銀線は、マイクロピペットの先端は準備以上の生理食塩液に進出されると回路を完成するために負端子に接続されている。
4. 保持電流は、マイクロピペットの先端が動脈壁に隣接して配置されている場合（または蛍光応答）血管拡張を防ぐために適用されます。現在保持すると、マイクロピペットの先端（内径= 1μm）とアゴニストの濃度の大きさによって異なりますが定義されたパラメータ（我々が1Mアセチルコリン、1μmの先端のための〜200 nAを使用する）ための高度に再現可能であるだろう。保持電流は、画像取得の開始と同期して電子トリガ（補足図1）を介して放出電流の配信と一致しなくなります。

3。マイクロマニピュレーション

1. XY顕微鏡ステージ用のカスタムプラットフォームは、強磁性ステンレス鋼で作製した。プラットフォームの寸法は（1 / 8"X 12"X 13"）、必要に応じて、実験準備の周り位置のマイクロマニピュレータ（図2A）に十分なスペースを有効にしてください。マグネットベースに固定されたマイクロマニピュレーターは、準備が指示として（図2B）の位置決めを可能にする。これらは、興味のあるサイト（図2C）での位置決めマイクロピペットの準備の周り作製プラットフォーム上に直接配置。

4。代表的な結果

1. マイクロピペットの先端が動脈に隣接して配置して、アセチルコリンに対する蛍光応答は、（AChの漏洩を防止するために調整よりも、現在の保持）があります。閾値刺激の下には効果がありませんでした。しかし、刺激強度が増加すると、内皮細胞のカルシウムの蛍光は、細動脈に沿って徐々に長い距離にわたって増加として刺激の部位（図3）で蛍光強​​度を行いました。

図1。 Microiontophoresisピペットをバックフィルするための方法。 A）マイクロキャピラリーチューブ（緑の矢印）はその後、1Mアセチルコリンで満たされた注射器に接続されている0.2μmのフィルター（紫矢印）に接続された圧縮フィッティング（青矢印）で固定されています。B）マイクロキャピラリーチューブが送り込まれているmicroiontophoresisのバックエンドを介してピペットおよびソリューションは、マイクロピペットの内腔を埋めるために変位する。C）は、ピペットがいっぱいになると、気泡（黒い矢印）を削除するためにダウンし、軽くテーパー上にフリックして先端を保持する。

図2。マイクロマニピュレータを配置するためのカスタムプラットフォーム。 A）強磁性ステンレス鋼のプラットフォームはXY並進ステージを含むカスタムMVX10顕微鏡のベース上に配置されたコンパクトな3軸のマイクロマニピュレータの底面に貼らB）円形マグネットベースはC）は 、実験準備の周りに配置マニピュレーター（関連するプロトコルを参照してください。。：特定の旧跡を研究するためにJoveのは、ID＃2874）。市販IRコンパクトなサイズと汎用性は、複数のマイクロピペットを同時に使用することもできるようになりました。

図3。細動脈のカルシウムの蛍光。細動脈壁の内側を覆う内皮細胞のカルシウムの蛍光は、刺激強度とともに増加した。に対する蛍光応答の画像を示されている最初の3つのパネル）250 NA、B）500 nAとC）、現在の1000年nAの放出（すべての500 msのパルス持続時間）。内皮細胞のカルシウムの蛍光が増加する距離は、AC（それぞれ〜130、270、400μmの、）の括弧で示されます。各パネル内の細動脈間の基準線は、アセチルコリンに対する蛍光応答（F / FO）は刺激の部位で記録した場所を示します。増加するAChの刺激のためのF / FO対時間のD）録音。現在の放出が増加するにつれて、F / FOは、振幅と持続時間に増加した。 100nAの刺激が閾値以下だと効果がないことに注意してください。

補足図1。電子トリガの回路図この回路は、パーソナルコンピュータからのパラレルポートとインタフェースです。それは、5Vの一定のTTLパルスを提供するときに活性化した。 7805チップは9 - 12V DC電源装置（適切な電圧の電池で結構です）に接続して5Vの電圧レギュレータです。 7805からの出力は、クワッドバイラテラルスイッチすると、回路の出力に電力を提供します。 1K抵抗の両端の入力は、コンピュータからです。

ディスカッション

ここで記述されたプロトコルはmicroiontophoresis用マイクロピペットを準備し実施するための方法を示しています。アセチルコリンの配信を、麻酔下のマウスの動脈にカルシウムシグナリング基礎内皮依存性血管拡張を説明するために使用されます。我々の結果は示しているアセチルコリンはmicroiontophoresisのマイクロピペット（図3）から現在の放出の強さで内皮細胞のカルシウムの蛍光の増加を増加する距離。安静時に蛍光増加の欠如は、マイクロピペットからのアセチルコリンの無視できる漏れを示します。 100nAの刺激の強度（図3、伝説）への応答の欠如は、刺激の閾値強度が増加する内皮細胞のカルシウムが必要であることを示しています。これらの技術は、容易に他の血管作動性薬剤と組織の準備に適応することができます。

実用的な考慮事項：細動脈の反応性を研究するmicroiontophoresisでの作業では、いくつかのことが認識されるべきである。それは納入アゴニストの実際の濃度を決定するために困難であることが判明している一方で、刺激 - 反応曲線は準備中との間で再現性があります。これらは、（;図3例、250、500、1000 nAの）パルス幅を一定に保持している（例えば、500ミリ秒）と現在の放出を変化させることによって行うことができます。また、現在の放出を一定に保つことができる（例えば、500 nAの）とパルス幅様々な（例えば、250、500および1000ミリ秒）。定義されたアゴニストの濃度のアクションへの参照の場合、製剤は、適切なソリューションを⁵で灌流することができます。溶質放出の駆動力は電荷の運動なので、配信されるエージェントは、マイクロピペットから避難する正味の電荷を運ぶ必要があります。興味のエージェントが一次電荷キャリアであることを保証するために、それは電気浸透を最小限に抑えるために高濃度（例えば、アセチルコリンのための1 M）で溶解される。これはマイクロピペット充填溶液のpHを操作する必要があるときは、車両のコントロールはどの非特異的な影響を把握する必要があります。適切なコントロールがまた単独での電流の通過のために実行する必要があります（例えば、等張生理食塩水で満たされたマイクロピペットを用いて）。リリースのそのサイトからのエージェントの普及のための効果的な距離は知ることが必要とマイクロピペットの位置にあるように最も容易に生理学的な応答（例えば、血管拡張やアセチルコリンの放出時に細胞内カルシウムの上昇）の消失によって経験的に決定され標的部位からの距離を定義する。実際には、効果的な拡散距離が大幅にマイクロピペットの先端が組織にどのように配置するかによって影響され、組織とその先端に押さ先端が閉塞されている場合など、排出が損なわれているよりも。過剰な結合組織は、特に面倒ですし、手術の準備中に、組織の表面から除去されるべきである。注目は、指定されたエージェントの先端を破壊する可能性を考慮する必要があります。これは、比較的短いパルス（例えば、≤1秒）を用いて最小化されます。持続的な電流（例えば、数秒）で、アゴニストは、それがマイクロピペットで、バルク充填溶液からの拡散によって置き換えることができるよりも急速に先端から追放されることがあります。

一つ（例えば^、+刺激を脱分極Kを配信するために）localイオン環境を変更しようとしている場合は無視できるボリュームは、microiontophoresisで置換されているので、これは以下にmicroiontophoresisで達成することはできますが、容易に希望をのバルク流体の圧力の排出によって達成される組成物。細動脈の局所的刺激の場合は2〜3μmの内径を持つマイクロピペットの先端には噴射圧力4月5日PSI（28から35 kPa）のと電磁弁¹⁰を制御するパルス幅（例えば、1秒）でうまく動作。微小血管へマイクロピペットからのエージェントの持続的な配信が必要な場合には、圧力の取り出しは、適切な内部先端径（例えば、〜10μm）を^11,12のマイクロピペットを用いて好適である。活栓バルブの既知の高さの静水圧列には、一定の圧力ヘッドのオン/オフの明確に定義された、安価に提供します。流量は、ピペットチップと駆動圧力の内径によって決定されます。いつものように、車両のコントロールは、圧力放出の非特異的な行動を排除するために不可欠です。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
使用する材料	会社	カタログ番号	コメント
ホウケイ酸ガラス毛細管	ワーナーインスツルメンツ	GC120F - 10
水平ピペットプラー	サターインスツルメンツ	モデルP - 97
塩化アセチルコリン	シグマアルドリッチ	A6625
ルアーハブ用のアダプタ	Martech	AC1343	マイクロキャピラリーチューブを保護するには
0.2μmのナイロンタイタンフィルター	日スリランカ	42204 - NN	損失を最小限に抑えるため、低保持容量
5 mlのシリンジ	ベクトンディッキンソン（株） -	309603
ピペットホルダー	ワーナーインスツルメンツ	E45W - M12VH
シルバーのワイヤ	ワーナーインスツルメンツ	AG10W	0.25ミリメートルの直径
3軸マニピュレーター	シスキユーデザインインスツルメンツ	DT3 - 100、MXB、MXC、MGB / 8	示すようにマニピュレータのためのコンポーネント
microiontophoresis現在のプログラマー	世界の精密機器	モデル260
トリガーデバイス	カスタム	カスタムの	回路はすべてCiNiiに用意。図1
ステンレス鋼板	マクマスター - カー	1 / 8"X 12"X 12"	設計によると、
激化するデジタルカメラ	スタンフォードフォトニクス株式会社	XR/Mega-10	パイパー制御ソフトウェアとの統合