Microiontophoresis ו המיקרומניפולציה עבור דימות פלואורסצנטי Intravital של microcirculation

Summary

Microiontophoresis כרוכה בתנועה של יונים מן micropipette בתגובה הבדל בפוטנציאל חשמלי בין בתוך ומחוץ micropipette. מולקולות פעילות ביולוגית מועברות ובכך ביחס זרם חשמלי. אנו מדגימים microiontophoresis אצטילכולין בשיתוף עם המיקרומניפולציה ללמוד האנדותל תלויי התרחבות ב microcirculation.

Abstract

Microiontophoresis כרוך במעבר של זרם דרך טיפ micropipette לספק המומס באתר ייעודי בתוך הכנה ניסיונית. Microiontophoresis יכול לדמות הילוכים הסינפטי ¹ על ידי אספקת נוירוטרנסמיטורים נוירופפטידים על נוירונים reproducibly ^2. נפח זניח (נוזל) עקירה נמנעת הפרעה מכנית הכנה הניסוי. התאמת בטכניקות אלה כדי microcirculation ³ אפשרה מנגנוני התרחבות ו vasoconstriction להיחקר ברמה המיקרוסקופית in vivo ^4,5. יתרון המפתח של משלוח מקומי כזה המאפשר תגובות וזומוטורים להיחקר באתרים מוגדרים בתוך רשת כלי הדם מבלי לעורר שינויים מערכתיים או רפלקסיבי בלחץ הדם זרימת הדם לרקמות, ובכך חושפים מאפיינים מהותיים של microvessels.

הגבלה של microiontophoresis היא כי הריכוז המדויק של סוכן נמסר לאתר של עניין קשה לברר ^6. עם זאת, השקתו מקצה micropipette הוא יחסי עוצמת ומשך פליטה הנוכחית ^2,7, כגון לשחזור כי הגירוי תגובה קשרים ניתן לקבוע בקלות תחת תנאים ניסויים מוגדר (המתואר להלן). גורמים נוספים המשפיעים על משלוח microiontophoretic כוללים ריכוז המומס ואת יינון שלה בתמיסה. הקוטר הפנימי של קצה micropipette יש ~ 1 מיקרומטר או פחות כדי למזער את "דליפה" diffusional, אשר ניתן לסתור עם זרם שמירה. לכן זרם החוצה (חיובי) משמש כדי להוציא קטיון ואת זרם שלילי בשימוש לשמור אותו בתוך micropipette.

המצאה של micropipettes הוא הקל עם מושכי אלקטרוניים מתוחכמים ^8. Micropipettes המגיעים צינורות זכוכית נימי המכיל נימה כי "פתילות" פתרון אל קצה micropipette כאשר מלא מקצה האחורי ("backfilled"). הדבר נעשה על ידי החדרת צינור microcapillary מחובר מזרק המכיל את הפתרון לעניין פתרון ולהוציא לתוך לומן של micropipette. Micromanipulators לאפשר המיקום הרצוי של micropipettes תוך הכנת הניסוי. Micromanipulators רכוב על בסיס מטלטלין ניתן למקם סביב הכנת בהתאם לטופוגרפיה של רשתות כלי הדם (שפותחה בהמשך).

הפרוטוקול הנוכחי מדגים microiontophoresis של אצטילכולין (ACH ⁺ Cl ^-) על עורקיק הכנה השריר עכבר cremaster (ראה פרוטוקול קשורים: מזהה יופיטר # 2874) כדי לייצר האנדותל תלויי התרחבות. משלוח Stimulus מסונכרן עם רכישת תמונה דיגיטלית באמצעות ההדק אלקטרוניים. השימוש Cx40 ^BAC-GCaMP2 העכברים הטרנסגניים ⁹ תגובות מאפשר הדמיה של סידן תוך תאי הבסיס התרחבות בתאי האנדותל arteriolar ב microcirculation האורחים.

Protocol

1. Animal Care ושימוש

בעקבות סקירה ואישור של טיפוח בעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש, עכברים זכרים לפחות 12 שבועות משמשים. העכבר הוא הרדים עם נתרן pentobarbital (60 מ"ג / ק"ג) באמצעות הזרקה (IP) intraperitoneal. במהלך ניתוחים ופרוטוקולים ניסיוני, הרדמה מתוחזק על ידי תוספי מזון (10-20% של הזרקת הראשוני, ip) לפי הצורך (כל 30-60 דקות, שמסומן על ידי תגובת נסיגה הבוהן או קמצוץ הזנב). לאחר השלמת הליך הניסוי העכבר הוא מנת יתר עם pentobarbital (IP) מורדמים על ידי נקע בצוואר הרחם.

2. Micropipettes ו Microiontophoresis

1. Micropipettes Microiontophoresis (קוטר קצה פנימי, ~ 1 מיקרומטר) מוכנים מן צינורות זכוכית בורוסיליקט נימי בעזרת פיפטה חולץ אופקי. שלנו יש ~ 5 להתחדד מ"מ עבור נוקשות; נרות יותר גמישים יותר.
2. Micropipettes הם backfilled עם 1M ACH (Figure1A-C) מומס 18.2 MΩ מים. בשביל למלא את משבצות, צינור microcapillary מחובר לסנן 0.2 מיקרומטר מצמידים את מזרק המכיל את אגוניסט של עניין (איור 1). אלה יכולים להיות מפוברק בקלות (להלן) או נרכשו מיצרנים מסחריים. צינור microcapillary מוכנס לתוך האחורי של הפתרון micropipette ו ACH מועבר לתוך לומן תוך הוצאת צינור microcapillary כמו micropipette ממלא. החזקת micropipette עם קצהו כלפי מטה, בועות אוויר יוסרו על ידי מצליף בעדינות micropipette.
3. Micropipette מובטחת בפומית רכוב micromanipulator (איור 2). לבעל יש חוט כסף חיבור פתרון אח בתוך micropipette להצמיד חיצוני, אשר בתורו מחובר להדק החיובי של מתכנת microiontophoresis. חוט כסף second מאובטח בקצה הכנת הרקמה מחובר למסוף השלילית כדי להשלים את המעגל כמו קצה micropipette הוא התקדם לתוך הפתרון מלח פיזיולוגיים על ההכנה.
4. הנוכחי תמך מוחל על מנת למנוע התרחבות (או בתגובה ניאון) כאשר קצה micropipette ממוקמת צמוד לקיר arteriolar. שימור הנוכחית תשתנה בהתאם לגודל של קצה micropipette (קוטר פנימי = 1 מיקרומטר) וריכוז אגוניסט אך ניתנת לשחזור מאוד פרמטרים מוגדרים (אנו משתמשים ~ 200 NA עבור 1M אח, טיפ 1 מיקרומטר). הנוכחי שמירה חדל ביחד עם משלוח של פליטה הנוכחי באמצעות ההדק אלקטרוניים (איור משלים 1) מסונכרן עם תחילת הרכישה של התמונה.

3. המיקרומניפולציה

1. פלטפורמה אישית לשלב מיקרוסקופ XY היה מפוברק מתוך נירוסטה פרומגנטי. ממדים פלטפורמה (1 / 8 "X 12" X 13 ") לאפשר מרחב מספיק כדי micromanipulators עמדה סביב הכנת הניסוי כפי Micromanipulators הרצוי (איור 2 א). מאובטחת לבסיסי מגנטי (תרשים 2B) לאפשר מיצוב כפי שמחייבת הכנה. אלה ממוקם ישירות סביב ההכנות micropipettes מיצוב באתרים בעלי עניין (איור 2C) על פלטפורמה מפוברק.

4. נציג תוצאות

1. עם קצה micropipette ממוקם בסמוך עורקיק, יש תגובה פלואורסצנטי ACH (שמירה הנוכחי מאשר מותאם כדי למנוע דליפה ACH). מתחת לסף גירוי היתה שום השפעה. עם זאת, כמו גירוי בעוצמה מוגברת, פלואורסצנטי תא האנדותל סידן מוגברת על פני מרחקים בהדרגה יותר לאורך עורקיק, כמו גם את עוצמת הקרינה באתר של גירוי (איור 3).

באיור 1. שיטה למלא את משבצות pipettes Microiontophoresis. א) צינור microcapillary (חץ ירוק) הוא מאובטח ב הולם דחיסה (חץ כחול) המצורפים 0.2 מיקרומטר מסנן (חץ סגול), אשר מחוברת אז מזרק מלא 1M אח. B) צינור microcapillary מוזן לתוך פיפטה microiontophoresis עד סוף פתרון לאחור הוא העקורים כדי למלא את לומן של micropipette. C) לאחר פיפטה מלא, החזק את קצה מטה בעדינות קפיצי להתחדד לעיל כדי להסיר בועות (חץ שחור).

איור 2. פלטפורמה אישית עבור מיקום Micromanipulator. ..) פלטפורמה פרומגנטי נירוסטה הושם על בסיס MVX10 אישית מיקרוסקופ המכיל הבמה XY translational B) בסיסים מגנטי חוזר מודבקת בתחתית 3-ציר micromanipulators קומפקטי C) Micromanipulators ממוקם סביב הכנת הניסוי (ראה פרוטוקול קשורים: מזהה יופיטר # 2874) ללמוד לאתרים ספציפיים של עניין.גודל ir צדדיות קומפקטי לאפשר micropipettes מרובים כדי לשמש בעת ובעונה אחת.

איור 3. Fluorescence סידן Arterioles. הקרינה של סידן לתאי אנדותל המצפים את הקיר arteriolar מוגברת בעוצמה גירוי. הראשון 3 פאנלים הראו תמונות של תגובות פלואורסצנטי) 250 NA, B) 500 NA ו-C) 1000 פליטה NA הנוכחי (כל 500 מילישניות משך הדופק). המרחק שעליו פלואורסצנטי תא האנדותל סידן מוגברת מסומן על ידי סוגריים ב AC (~ 130, 270 ו - 400 מיקרומטר, בהתאמה). קו התייחסות על פני עורקיק בחלונית מציין היכן כל התגובות פלואורסצנטי (F / FO) כדי ACH נרשמו באתר של גירוי. ד) הקלטות של זמן לעומת F / FO להגדלת גירויים אח. כמו פליטה הנוכחי גדל, גדל F / FO ב משרעת ומשך. שים לב, 100 גירוי NA היה מתחת לסף ולא היה לו שום השפעה.

משלים באיור 1. תרשים מעגל עבור ההדק אלקטרוניים. במעגל זה interfaced עם יציאה מקבילית ממחשב אישי. כאשר מופעל הוא מספק קבוע TTL הדופק של 5V. השבב 7805 הוא מתח 5V הרגולטור המחובר לספק DC 9-12V צריכת חשמל (סוללה של מתח מתאים זה בסדר). פלט של 7805 מספקת חשמל למתג בילטראליים Quad ו הפלט של המעגל. קלט פני הנגד 1K הוא מהמחשב.

Discussion

פרוטוקול המתואר כאן מדגים שיטות להכנת ויישום micropipettes עבור microiontophoresis. מסירה של אצטילכולין משמש כדי להמחיש איתות סידן התרחבות הבסיסית האנדותל תלויי ב arterioles של העכבר בהרדמה. התוצאות שלנו להמחיש כי המרחק שעליו אח מגבירה תא האנדותל סידן מגביר את הקרינה עם עוצמת פליטה הנוכחית מ micropipette microiontophoresis (איור 3). חוסר להגדיל הקרינה בתנאים מנוחה מציין זליגת זניח של אח של micropipette. חוסר תגובה לגירוי בעוצמה NA 100 (איור 3, אגדה) ממחישה כי עוצמת סף גירוי נדרש סידן תא האנדותל כדי להגדיל. טכניקות אלו ניתן להתאים בקלות סוכני vasoactive אחרים ההכנות רקמות.

שיקולים מעשיים: בעבודה עם microiontophoresis ללמוד תגובתיות arteriolar, כמה דברים צריך להיות מוכר. אמנם הוכיחה קשה לקבוע את ריכוז בפועל של אגוניסט נמסר, בתגובה לגירוי עקומות ולייצר בתוך ובין ההכנות. אלה ניתן לבצע על ידי לחיצה משך דופק קבוע (למשל, 500 ms) לבין משתנים פליטה הנוכחי (למשל, 250, 500 ו - 1000 NA; איור 3). לחלופין, פליטה הנוכחי ניתן לקיים קבוע (למשל, 500 NA) והדופק משך מגוונים (למשל, 250, 500 ו 1000 ms). לקבלת התייחסות לפעולות של ריכוז אגוניסט מוגדר, הכנת ניתן superfused עם הפתרון המתאים ^5. בגלל הכוח המניע פליטה המומס תנועה מטען חשמלי, הסוכן יועברו לשאת מטען נטו להיות שעזבו micropipette. על מנת להבטיח כי הסוכן של עניין היא נושאת מטען ראשוני, הוא מומס בריכוז גבוה (למשל, 1 M עבור ACH) כדי למזער אלקטרו אוסמוזה. כאשר זה דורש מניפולציה של ה-pH של התמיסה מילוי micropipette, פקדי הרכב נדרשים לוודא תופעות ספציפי. בקרות מתאימות צריך גם להתבצע למעבר הנוכחי בלבד (למשל, באמצעות micropipettes מלא מלוחים איזוטוני). המרחק יעיל דיפוזיה של הסוכן שלה מהאתר של שחרור יש לוודא והוא נקבע על ידי רוב בקלות אמפירית היעלמותו של תגובה פיזיולוגית (למשל, התרחבות או עלייה סידן תאיים על פליטה של ​​ACH) כמו micropipette ממוקמת מוגדרים מרחקים מאתר היעד. בפועל, המרחק דיפוזיה יעילה מושפעת במידה רבה על ידי האופן שבו קצה micropipette ממוקם בתוך הרקמה, למשל, אם קצה לחוץ לתוך הרקמה ואת קצהו הוא occluded, מאשר פליטה נפגעת. רקמת חיבור מופרז הוא בעייתי במיוחד, יש להסיר מפני השטח רקמות במהלך הכנת כירורגית. שימו לב צריך גם לתת אפשרות של depleting קצה סוכן המיועד. זה ממוזער באמצעות פולסים קצרים יחסית (למשל, ≤ 1 ים). עם זרמים ממושך (למשל, מספר שניות), אגוניסט עשוי להיות מגורש מקצה במהירות רבה יותר מאשר הוא יכול להיות מוחלף על ידי דיפוזיה מפתרון מילוי בתפזורת ב micropipette.

בגלל נפח זניח מוחלפת עם microiontophoresis, אם הוא מנסה לשנות את הסביבה יוניים המקומית (למשל, כדי לספק K depolarizing גירוי ^+), זה לא יכול להתבצע ביעילות עם microiontophoresis אבל מושגת בקלות עם פליטה לחץ של נוזלים בצובר לאחר הרצוי הרכב. לגירוי מקומי של עורקיק, טיפים micropipette עם קוטר פנימי של 2-3 מיקרומטר לעבוד היטב עם הלחץ פליטה 4-5 psi (28-35 kPa) ואת הדופק משך (למשל, 1 שנייה) שבשליטת עם שסתום סולנואיד ^10. איפה אספקה ​​מתמשכת של סוכן מן micropipette על microvessel נדרש, פליטה הלחץ הוא העדיף להשתמש micropipettes בקוטר המתאים קצה פנימית (למשל, ~ 10 מיקרומטר) ^11,12. טור ההידרוסטטי של גובה ידוע עם שסתום שסתום מספק זול, מוגדרים היטב on / off ראש לחץ מתמיד. שיעורי זרימה נקבעים על ידי בקוטר הפנימי של קצה פיפטה והלחץ נהיגה. כמו תמיד, פקדי הרכב חיוניים כדי למנוע פעולות ספציפי של פליטה הלחץ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
חומר המשמש	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
בורוסיליקט צינורות זכוכית נימי	וורנר מכשירים	GC120F-10
אופקי פיפטה פולר	סאטר מכשירים	דגם P-97
אצטילכולין כלוריד	סיגמא אולדריץ	A6625
מתאם Luer הרכזת	Martech	AC1343	כדי לאבטח את צינורות microcapillary
ניילון 0.2 מיקרומטר טיטאן מסנן	יום ראשון סרי	42204-NN	שימור נפח נמוך כדי להקטין את איבוד
5 מ"ל במזרק	בקטון דיקינסון-ושות	309603
פיפטה מחזיק	וורנר מכשירים	E45W-M12VH
כסף Wire	וורנר מכשירים	AG10W	0.25mm בקוטר
3 ציר micromanipulator	Siskiyou עיצוב מכשירים	DT3-100, MXB, MXC, מג"ב / 8	רכיבים עבור מניפולטור כפי שמוצג
microiontophoresis הנוכחית מתכנת	העולם מכשירי דיוק	דגם 260
המכשיר הדק	מנהג	מנהג	מעגל הניתנים Suppl. איור 1
חלד פלדה	מקמאסטר-קאר	1 / 8 "X 12" X 12 "	על פי התכנון
מוגברת מצלמה דיגיטלית	סטנפורד Photonics Inc	XR/Mega-10	משולב עם פייפר בקרת תוכנה