Microiontophoresis und Mikromanipulation für Intravital Fluoreszenz-Imaging der Mikrozirkulation

Zusammenfassung

Microiontophoresis bringt Bewegung von Ionen aus einer Mikropipette in Reaktion auf eine Differenz des elektrischen Potentials zwischen den innerhalb und außerhalb der Mikropipette. Biologisch aktive Moleküle sind dabei im Verhältnis zur elektrischen Strom geliefert. Wir illustrieren Acetylcholin microiontophoresis in Verbindung mit Mikromanipulation an Endothel-abhängige Vasodilatation in der Mikrozirkulation zu untersuchen.

Zusammenfassung

Microiontophoresis bringt Stromdurchgang durch eine Mikropipette Spitze zu einer Lösung an einem bestimmten Ort zu liefern innerhalb einer experimentellen Vorbereitung. Microiontophoresis kann synaptischen Transmission ¹ durch Bereitstellung von Neurotransmittern und Neuropeptiden auf Neuronen reproduzierbar ² zu simulieren. Vernachlässigbares Volumen (Flüssigkeit) Verschiebung verhindert mechanische Störung des experimentellen Vorbereitung. Die Anpassung dieser Techniken, um die Mikrozirkulation ³ hat aktiviert Mechanismen der Vasodilatation und Vasokonstriktion auf der mikroskopischen Ebene in vivo ^4,5 untersucht werden. Ein wesentlicher Vorteil einer solchen lokalisierte Abgabe ist damit vasomotorische Reaktionen auf an definierten Stellen innerhalb eines mikrovaskulären Netzwerk ohne evozieren systemischen oder reflexive Änderungen in Blutdruck und Gewebedurchblutung und verrät so intrinsischen Eigenschaften von Mikrogefäßen untersucht werden.

Eine Einschränkung der microiontophoresis ist, dass die genaue Konzentration des Mittels auf die Baustelle geliefert von Interesse schwer zu ermitteln ⁶ ist. Dennoch, seine Entlassung aus der Mikropipette Spitze proportional zur Intensität und Dauer der Auswurf aktuellen ^2,7 ist, kann, so dass reproduzierbare Reiz-Reaktions-Beziehungen leicht unter definierten experimentellen Bedingungen (siehe unten) ermittelt werden. Zusätzliche Faktoren, die microiontophoretic Lieferung mit Konzentration an gelösten Stoffen und deren Ionisierung in Lösung. Der Innendurchmesser der Mikropipette Spitze sollte ~ 1 um oder weniger sein, Diffusions "Leck", die mit einem Sicherungsring aktuellen entgegengewirkt werden kann minimiert werden. So eine äußere (positive) Strom wird verwendet, um ein Kation und ein negativer Strom verwendet werden, um sie innerhalb der Mikropipette halten auszuwerfen.

Herstellung von Mikropipetten mit ausgefeilten elektronischen Abzieher ⁸ erleichtert. Mikropipetten werden aus Glaskapillaren mit einem Filament, das gezogen wird "Dochte"-Lösung in die Spitze der Mikropipette, wenn sie aus dem Back-End ("verfüllt") gefüllt. Dies wird durch das Einfügen eines Mikrokapillare Rohr verbunden, um eine Spritze mit der Lösung von Interesse und Auswerfen der Lösung in das Lumen der Mikropipette getan. Mikromanipulatoren ermöglichen gewünschte Platzierung der Mikropipetten innerhalb der experimentellen Vorbereitung. Mikromanipulatoren auf einem fahrbaren Untersatz montiert werden rund um die Zubereitung im Sinne der Topographie des mikrovaskulären Netzwerken (entwickelt unten) positioniert werden.

Das vorliegende Protokoll zeigt microiontophoresis von Acetylcholin (ACh ⁺ Cl ^-) auf einer Arteriole der Maus cremaster Muskel-Präparat (siehe zugehörige Protokoll: JoVE ID # 2874) an Endothel-abhängige Vasodilatation zu erzeugen. Stimulus Lieferung mit digitalisierten Bildaufnahme mit einem elektronischen Auslöser synchronisiert. Die Verwendung von Cx40 ^BAC-GCaMP2 transgenen Mäusen ⁹ ermöglicht Visualisierung der intrazellulären Calcium-Reaktionen zugrunde liegenden Vasodilatation in Arteriolen Endothelzellen in den lebendigen Mikrozirkulation.

Protokoll

1. Animal Care und Verwenden

Nach Überprüfung und Genehmigung von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses sind männliche Mäuse mindestens 12 Wochen alt werden. Eine Maus ist mit Pentobarbital-Natrium (60 mg / kg) durch intraperitoneale (ip) Injektion. Während chirurgischer Eingriffe und experimentelle Protokolle, wird die Narkose durch Nachträge (10-20% der ersten Injektion, ip) bei Bedarf (; gekennzeichnet durch Rückzug als Reaktion auf Zehe oder Schwanz kneifen alle 30-60 Minuten) gehalten. Nach Abschluss der experimentellen Verfahren der Maus ist mit Pentobarbital (ip) und eingeschläfert durch Genickbruch überdosiert.

2. Mikropipetten und Microiontophoresis

1. Microiontophoresis Mikropipetten (intern Spitzendurchmesser, ~ 1 m) sind aus Borosilikatglas Kapillarröhrchen mit einem horizontalen Pipette puller vorbereitet. Unsere haben eine ca. 5 mm Kegel für Steifigkeit, längere verjüngt sind flexibler.
2. Mikropipetten mit 1M ACh (Abbildung1A-C) in 18,2 MOhm Wasser gelöst verfüllt. Für Verfüllung ist eine Mikrokapillare Rohr bis 0,2 um-Filter gekoppelt mit einer Spritze mit dem Agonisten des Interesses (Abbildung 1) verbunden. Diese können leicht hergestellt werden (siehe unten) oder gekauft von kommerziellen Anbietern. Die Mikrokapillare Rohr wird in das hintere Ende der Mikropipette und ACh-Lösung ist in das Lumen geliefert, während Zurückziehen der Mikrokapillare Rohr als Mikropipette füllt eingefügt. Halten Sie die Mikropipette mit der Spitze nach unten zeigt, werden Luftblasen durch leichtes Schnippen der Mikropipette entfernt.
3. Die Mikropipette ist in einer Halterung in einem Mikromanipulator (Abbildung 2) montiert ist. Der Halter hat einen Silberdraht Anschluss der ACh-Lösung innerhalb der Mikropipette auf einen externen Pin, die wiederum an den Pluspol einer microiontophoresis Programmierer angeschlossen ist. Eine zweite Silberdraht am Rand des Gewebes Vorbereitung gesichert ist an den Minuspol der Schaltung verbunden vollständig wie die Spitze der Mikropipette in die physiologische Kochsalzlösung über die Vorbereitung fortgeschritten.
4. A Haltestrom wird angewandt, um eine Vasodilatation zu verhindern (oder fluoreszierenden response), wenn der Mikropipette Spitze positioniert ist neben der arteriellen Wand. Beibehalten Strom wird mit der Größe der Mikropipette Spitze (Innendurchmesser = 1 m) und Agonistkonzentration variieren, liegt aber in hohem Maße reproduzierbar für definierte Parameter (wir verwenden ~ 200 nA für 1M ACh, 1 um tip). Die Beibehaltung Strom mehr deckungsgleich mit der Lieferung eines Rückschlags Strom über den elektronischen Auslöser (Supplementary Abbildung 1) mit dem Beginn der Bildaufnahme synchronisiert.

3. Mikromanipulation

1. Eine benutzerdefinierte Plattform für einen XY Mikroskoptisch wurde aus ferromagnetischen Edelstahl gefertigt. Platform Abmessungen (8.1 "x 12" x 13 ") ermöglichen genügend Raum zu positionieren Mikromanipulatoren rund um die experimentelle Vorbereitung wie gewünscht (Abbildung 2A). Mikromanipulatoren gesichert, um magnetische Basen (Abbildung 2B) ermöglichen die Positionierung als durch die Herstellung diktiert. Diese sind direkt auf den hergestellten Plattform rund um die Vorbereitung für die Positionierung Mikropipetten auf Seiten von Interesse (Abbildung 2C) platziert.

4. Repräsentative Ergebnisse

1. Mit der Mikropipette Spitze benachbart zu einer Arteriole, gibt es Fluoreszenz-Reaktion auf ACh (Haltestrom als angepasst, um ein Auslaufen zu verhindern ACh). Unterhalb einer Schwelle Reiz gab es keinen Effekt. Doch wie Reizintensität, erhöhte endotheliale Kalzium Fluoreszenz über schrittweise größere Entfernungen entlang der Arteriole, ebenso wie die Intensität der Fluoreszenz am Ort der Stimulation (Abbildung 3).

Abbildung 1. Verfahren zur Verfüllung Microiontophoresis Pipetten. A) Ein Mikrokapillare Rohr (grüner Pfeil) ist in einer Klemmverschraubung (blauer Pfeil) an einem 0,2 um-Filter (lila Pfeil), die dann mit einer Spritze mit 1 M ACh gefüllt ist angebracht gesichert. B) Die Mikrokapillare Rohr wird in die eingespeist microiontophoresis Pipette durch den Back-End und die Lösung wird verschoben, um das Lumen der Mikropipette. C ausfüllen) Nachdem die Pipette gefüllt ist, halten Sie die Spitze nach unten und sanft Flick über den Kegel zu Blasen (schwarzer Pfeil) entfernen.

Abbildung 2. Benutzerdefinierte Plattform für Mikromanipulator Placement. .. A) A ferromagnetischen Edelstahl-Plattform wurde auf einem benutzerdefinierten MVX10 Mikroskop Base mit einem XY-translationale Bühne platziert B) Circular magnetische Basen an der Unterseite der kompakten 3-Achsen-Mikromanipulatoren angebracht C) Mikromanipulatoren rund um die experimentelle Vorbereitung positioniert (siehe zugehörige Protokoll: JoVE ID # 2874) zu studieren bestimmte Gebiete von Interesse. Dieir kompakte Größe und Vielseitigkeit ermöglichen mehrere Mikropipetten gleichzeitig verwendet werden.

Abbildung 3. Calcium-Fluoreszenz in den Arteriolen. Calcium Fluoreszenz von Endothelzellen der Arteriolen Wand nahm mit Reizintensität. Die ersten 3 Platten gezeigten Bilder der Fluoreszenz Reaktionen auf A) 250 nA, B) 500 nA und C) 1000 nA Auswurf Strom (alle 500 ms Pulsdauer). Die Entfernung, über die Endothelzellen Kalzium Fluoreszenz erhöht wird durch Klammern in AC (~ 130, 270 und 400 um jeweils) angegeben. Die Bezugslinie über die Arteriole in jedes Panel zeigt an, wo Fluoreszenz Antworten (F / Fo) zu ACh an der Stelle der Anregung aufgenommen wurden. D) Aufnahmen von F / Fo-Zeit für die Erhöhung ACh Reize. Als Auswurf aktuellen, erhöhte F / Fo in Amplitude und Dauer. Beachten Sie, dass 100 nA Stimulus unterhalb Schwelle war und hatte keine Wirkung.

Ergänzende Abbildung 1. Schaltplan für die elektronische auslösen. Diese Schaltung ist über eine Schnittstelle mit einer parallelen Schnittstelle von einem PC. Wenn diese Funktion aktiviert es eine Konstante TTL Puls von 5V zur Verfügung stellt. Der 7805 Chip ist ein 5V-Spannungsregler verbunden mit einem 9-12V DC Netzteil (eine Batterie von entsprechenden Spannung ist in Ordnung). Output aus der 7805 versorgt das Quad Bilateral Switch und den Ausgang der Schaltung. Eingang über den 1K Widerstand ist aus dem Computer.

Diskussion

Die hier beschriebene Protokoll zeigt Methoden für die Vorbereitung und Durchführung von Mikropipetten für microiontophoresis. Lieferung von Acetylcholin wird verwendet, um Calcium-Signalgebung zugrunde liegenden Endothel-abhängige Vasodilatation in Arteriolen der narkotisierten Maus zu illustrieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Distanz, über die ACh erhöht Endothelzellen Kalzium Fluoreszenz steigt mit der Intensität eines Rückschlags Strom aus dem microiontophoresis Mikropipette (Abbildung 3). Das Fehlen von Fluoreszenz-Anstieg unter Ruhebedingungen zeigt vernachlässigbar Austreten von ACh aus der Mikropipette. Der Mangel an Reaktion auf 100 nA Reizintensität (Abbildung 3, Legende) zeigt, dass eine Schwelle Intensität der Stimulation für Endothelzellen Kalzium zu erhöhen ist nicht erforderlich. Diese Techniken können ohne weiteres auf andere vasoaktive Substanzen und Gewebe Vorbereitungen angepasst werden.

Praktische Überlegungen: In Zusammenarbeit mit microiontophoresis zu arteriolären Reaktivität Studie, einige Dinge sollten anerkannt werden. Während sie sich bewährt hat schwierig, die tatsächliche Konzentration des Agonisten geliefert zu bestimmen, sind Reiz-Reaktions-Kurven reproduzierbar innerhalb und zwischen den Präparaten. Diese können durch Halten Pulsdauer konstant (z. B. 500 ms) und die Variation der Auswurf Strom (; Abbildung 3 z. B. 250, 500 und 1000 nA) durchgeführt werden. Alternativ können Auswurf aktuellen konstant gehalten werden (zB 500 nA) und Pulsdauer variiert (z. B. 250, 500 und 1000 ms). Für einen Verweis auf die Aktionen eines definierten Agonistkonzentration kann die Zubereitung mit der entsprechenden Lösung ⁵ superfundiert werden. Da die treibende Kraft für gelöste Auswurf ist elektrische Ladung Bewegung, muss der Agent zu liefernden tragen eine Nettoladung von der Mikropipette verschoben werden. Um sicherzustellen, dass der Agent von Interesse primären Ladungsträger ist, wird es in hoher Konzentration (z. B. 1 M für ACh) aufgelöst, um Elektro-Osmose zu minimieren. Wenn diese Manipulation des pH-Wertes der Mikropipette Füllung Lösung erfordert, sind auf ein Fahrzeug steuert verpflichtet, eine unspezifische Effekte zu ermitteln. Entsprechende Kontrollen sollten auch für die Durchfahrt der aktuellen alleine durchgeführt werden (zB mittels Mikropipetten mit isotonischer Kochsalzlösung gefüllt). Die tatsächliche Reichweite für die Diffusion des Wirkstoffes aus dem Ort der Freisetzung sollte sichergestellt werden, und ist am ehesten empirisch durch das Verschwinden einer physiologischen Reaktion (z. B. Gefäßerweiterung oder ein Anstieg der intrazellulären Calcium auf Auswerfen der ACh) bestimmt als Mikropipette bei positioniert ist definierten Abständen aus der Ziel-Site. In der Praxis ist der effektive Diffusionsweg stark durch, wie die Spitze der Mikropipette wird im Gewebe positioniert beeinflusst, z. B. wenn die Spitze nach unten in das Gewebe und die Spitze gedrückt verschlossen ist, als Auswurf beeinträchtigt wird. Übermäßige Bindegewebe ist besonders problematisch und sollte von der Gewebeoberfläche bei chirurgischen Präparation entfernt werden. Augenmerk sollte auch auf die Möglichkeit, die zum Abbau der Spitze des Beauftragten gegeben werden. Dies wird durch relativ kurze Impulse (zB ≤ 1 s) minimiert. Bei anhaltend Strömen (zB einige Sekunden), kann die Agonisten von der Spitze vertrieben schneller sein, als es durch Diffusion aus der Schüttung Lösung in der Mikropipette ersetzt werden kann.

Da vernachlässigbares Volumen mit microiontophoresis verdrängt wird, wenn man versucht, die lokale ionische Milieu zu ändern (zB um eine depolarisierende K liefern ⁺ Stimulus), kann dies nicht effektiv mit microiontophoresis erreicht werden, ist aber leicht mit Druck Ausstoß von Bulk-Flüssigkeit mit den gewünschten erreicht Zusammensetzung. Für die lokale Stimulation einer Arteriole, Arbeit Mikropipettenspitzen mit einem Innendurchmesser von 2-3 um auch mit Auswurf Pressure 4-5 psi (28-35 kPa) und Pulsdauer (zB 1 Sekunde) mit einem Magnetventil ¹⁰ gesteuert. Wo verzögerten Abgabe eines Agenten aus einer Mikropipette auf eine microvessel erforderlich ist, wird Druck Auswurf bevorzugt mit Mikropipetten geeignete interne Spitzendurchmesser (zB ~ 10 pm) ^11,12. Eine hydrostatische Säule bekannter Höhe mit einem Absperrhahn bietet eine kostengünstige, on / off konstantem Druck Kopf gut definiert. Der Durchfluss durch den inneren Durchmesser der Pipettenspitze und der treibende Druck bestimmt. Wie immer, sind auf ein Fahrzeug steuert wichtig, unspezifische Maßnahmen der Druck Auswurf auszuschließen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Verwendete Material	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Borosilikatglas Kapillarröhrchen	Warner Instruments	GC120F-10
Horizontal Pipette Puller	Sutter Instruments	Modell P-97
Acetylcholinchlorid	Sigma-Aldrich	A6625
Adapter für Luer-Hub	Martech	AC1343	Um Mikrokapillare Schlauch sichern
0,2 mu m Nylon Titan-Filter	So Sri	42204-NN	Low Retentionsvolumen, um den Verlust zu minimieren
5 ml Spritze	Becton-Dickinson Co.	309603
Pipettenhalter	Warner Instruments	E45W-M12VH
Silver Wire	Warner Instruments	AG10W	0,25 Durchmesser
3-Achs-Mikromanipulator	Siskiyou Design-Instruments	DT3-100, MXB, MXC, MGB / 8	Komponenten für Manipulator wie gezeigt
microiontophoresis aktuellen Programmierer	World Precision Instruments	Modell 260
Auslöseeinrichtung	Brauch	Brauch	Schaltung versehen in Suppl. Abbildung 1
Edelstahlplatte	McMaster-Carr	1 / 8 "X 12" X 12 "	Nach Konstruktion
Verstärkte Digital Camera	Stanford Photonics Inc.	XR/Mega-10	Integriert mit Piper-Control-Software