Microiontophoresis и Микроманипуляция для Прижизненное флуоресценции микроциркуляции

Резюме

Microiontophoresis влечет за собой перемещение ионов из микропипетки в ответ на разность электрических потенциалов между внутренней и внешней микропипетки. Биологически активные молекулы таким образом доставляется в пропорции к электрическим током. Проиллюстрируем ацетилхолина microiontophoresis в сочетании с микроманипуляция изучать эндотелий-зависимой вазодилатации в микроциркуляции.

Аннотация

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission¹ by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly². Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation³ has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo^4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.

A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain⁶. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current^2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be ˜ 1 μm or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.

Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers⁸. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below).

The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh⁺ Cl^-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40^BAC-GCaMP2 transgenic mice⁹ enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

протокол

1. Уходу и использованию животных

После рассмотрения и одобрения со стороны институциональных уходу и использованию животных комитета, мышей-самцов не менее 12 недель использования. Мышь анестезией с фенобарбиталом натрия (60 мг / кг) через внутрибрюшинного (ф) инъекции. На протяжении хирургических процедур и экспериментальных протоколов, анестезия поддерживается за счет добавки (10-20% от первоначальной инъекции, ф) по мере необходимости (каждые 30-60 минут, указывает выход ответ на ноги или хвост щепотку). После завершения экспериментальной процедуры мышь передозировки с фенобарбиталом (ф) и эвтаназии цервикальным сдвигом.

2. Микропипетки и Microiontophoresis

1. Microiontophoresis микропипетки (внутренний диаметр кончика, ~ 1 мкм) получают из боросиликатного стекла капилляров использованием горизонтальных съемник пипетки. Наши иметь ~ 5 мм Конус для жесткости; больше сужается являются более гибкими.
2. Микропипетки которые засыпаны 1M АХ (Figure1A-C), растворенного в 18,2 МОм воды. Для засыпки, микрокапиллярных трубка подключена к 0,2 мкм фильтр соединен с шприц, содержащий агонист интереса (рис. 1). Они могут быть легко сфабрикованы (см. ниже) или купить у коммерческих поставщиков. Микрокапиллярных трубка вставляется в заднюю часть микропипетки и АЧ решение поставляется в просвет при выводе микрокапиллярных трубку, как микропипетки заливки. Холдинг микропипетки с его кончик направлен вниз, пузырьки воздуха удаляют, осторожно стряхивая микропипетки.
3. Микропипетки закреплен в держателе установлен в микроманипулятора (рис. 2). Обладатель серебряной провод, соединяющий решение АЧ в микропипетки на внешний вывод, что, в свою очередь, подключен к положительному выводу microiontophoresis программиста. Второй серебряной проволоки закреплены на краю тканевого препарата связан с отрицательным выводом для завершения цепи, как кончик микропипетки является передовой в физиологическом растворе в течение подготовки.
4. Сохраняя ток применяется для предотвращения вазодилатации (или люминесцентные ответ), когда кончик микропипетки расположен рядом с артериол стене. Сохранение ток будет меняться в зависимости от размера кончика микропипетки (внутренний диаметр = 1 мкм) и агонист концентрации, но очень воспроизводимые для определенных параметров (мы используем ~ 200 нА для 1M АХ, 1 мкм совет). Сохранение текущей перестает совпадающих с доставкой выброса тока через электронные триггером (дополнительные рис. 1) синхронизирован с началом получения изображений.

3. Микроманипуляция

1. Пользовательские платформы для столик микроскопа XY был изготовлен из ферромагнитного нержавеющей стали. Размеры платформы (1 / 8 "X 12" X 13 ") позволяют достаточно места для размещения микроманипуляторами вокруг экспериментальной подготовке в соответствии с пожеланиями (рис. 2А). Микроманипуляторы прикреплены к магнитной базы (рис. 2Б) позволяют позиционирование как это диктуется подготовки. Это размещаются непосредственно на сфабрикованных площадку вокруг подготовки к позиционирования микропипетки на интересные сайты (рис. 2С).

4. Представитель Результаты

1. С кончика микропипетки расположен рядом с артериол, есть флуоресценции ответ на АХ (сохраняя ток, чем регулируется для предотвращения утечки АЧ). Ниже порога стимула не было никакого эффекта. Однако, как интенсивности раздражения увеличилась, эндотелиальные флуоресценции кальция клетка постепенно увеличилась за большего расстояния по артериол, как и интенсивность флуоресценции на месте раздражения (рис. 3).

Рисунок 1. Метод Засыпка Microiontophoresis Пипетки. ) Микрокапиллярных трубки (зеленая стрелка) закреплен в компрессионный фитинг (синяя стрелка), подключенных к 0,2 мкм (фиолетовая стрелка), который затем прикрепляется к шприц с 1М АХ. B) микрокапиллярных трубки подается в microiontophoresis пипетки через задний конец и решения смещается, чтобы заполнить просвет микропипетки. C) После пипетки заполнен, удерживая наконечник вниз и мягко Флик выше конус для удаления пузырьков (черная стрелка).

Рисунок 2. Custom Платформа микроманипулятора размещения. ..) Ферромагнитной нержавеющей стали платформы был сделан на пользовательский MVX10 микроскопом базу, содержащую XY поступательного стадии B) Циркуляр магнитного баз прикреплены к нижней части компактный 3-х осевой микроманипуляторами C) Микроманипуляторы расположены вокруг экспериментальной подготовки (См. связанный протокол: Юпитер ID # 2874) для изучения конкретных объектов, представляющих интерес.л компактные размеры и универсальность позволяют нескольким микропипетки, которые будут использоваться одновременно.

Рисунок 3. Кальций флуоресценции в артериол. Кальций флуоресценции эндотелиальных клеток, выстилающих артериол стены увеличилась с интенсивности раздражения. Первые 3 панели показано изображение флуоресценции ответы) 250 нА, В) 500 нА и C) 1000 нА выброса тока (всего 500 мс длительность импульса). Расстояние, на котором эндотелиальных флуоресценции кальция клетка увеличилась указывается в скобках переменного тока (~ 130, 270 и 400 мкм соответственно). Опорной линии через артериол в каждой панели указывает, где флуоресценция ответов (F / Fo) к АХ были записаны в месте раздражения. D) Записи F / Фо время против повышения стимулов АХ. Как выброса текущей увеличилось, F / Фо увеличился по амплитуде и длительности. Обратите внимание, что 100 нА стимул был ниже порога и не подействовало.

Дополнительное рисунке 1. Принципиальная схема электронного триггера. Эта схема сопряжена с параллельным портом с персонального компьютера. При активации он обеспечивает постоянное TTL импульсов 5В. 7805 чип регулятор напряжения 5В подключены к 9-12В постоянного тока (аккумулятора соответствующего напряжения штраф). Выход из 7805 обеспечивает питание для Quad Двусторонние коммутатор и выход схемы. Входной через 1K резистор от компьютера.

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, демонстрирует методы подготовки и реализации микропипетки для microiontophoresis. Доставка ацетилхолина используется для иллюстрации кальциевой сигнализации основной эндотелий-зависимой вазодилатации в артериолы наркозом мыши. Наши результаты показывают, что расстояние, на котором АЧ увеличивает эндотелия увеличивает кальция клетка флуоресценция с интенсивностью выброса тока от microiontophoresis микропипетки (Рис. 3). Отсутствие флуоресценции увеличение в состоянии покоя указывает незначительной утечки АЧ из микропипетки. Отсутствие реакции на 100 нА интенсивности раздражения (рис. 3, легенды) показывает, что пороговая интенсивность стимуляции требуется для эндотелиальных кальция клетка увеличивается. Эти методы могут быть легко адаптированы для других вазоактивных агентов и тканевые препараты.

Практические соображения: В работе с microiontophoresis изучать артериол реактивности, несколько вещей, которые должны быть признаны. Хотя это оказалось трудным для определения фактической концентрации агониста доставлен, стимул-реакция кривые воспроизводимых внутри и между препаратами. Они могут быть выполнены путем проведения постоянной длительности импульса (например, 500 мс) и различной выброса тока (например, 250, 500 и 1000 нА, рисунок 3). Кроме того, выброс ток может быть постоянным (например, 500 нА) и длительностью импульса разнообразны (например, 250, 500 и 1000 мс). Для ссылки на действия определен агонист концентрации, препарат может быть superfused с соответствующим решением ^5. Потому что движущей силой для растворенного вещества выброса электрического движения заряда, агент должен быть доставлен нести суммарный заряд быть перемещены из микропипетки. Чтобы убедиться, что агент интересов первичных носителей заряда, он растворяется при высокой концентрации (например, 1 м для АЧ), чтобы минимизировать электроосмос. Когда это требует манипулирования рН раствора заполнения микропипетки, транспортное средство контроля необходимо установить какой-либо неспецифических эффектов. Соответствующие элементы управления должны быть выполнены для прохождения тока в одиночку (например, с помощью микропипетки заполнены изотонический солевой раствор). Эффективное расстояние для диффузии агент от своего сайта релиз должен быть установлен и является наиболее легко определить эмпирическим путем исчезновения физиологического ответа (например, расширение кровеносных сосудов или повышение внутриклеточного кальция на выброс ацетилхолина) в качестве микропипетки позиционируется на определены расстояния от целевой сайт. На практике эффективная длина диффузии в значительной степени зависит от того, как кончик микропипетки позиционируется в ткани, например, если кончик нажатой в ткани и ее наконечник окклюзии, чем выброс нарушается. Чрезмерное соединительной ткани особенно хлопотным и должны быть удалены из поверхности ткани во время хирургической подготовки. Внимание следует также уделить возможности истощения кончик назначенным агентом. Это сводится к минимуму, используя сравнительно коротких импульсов (например, ≤ 1 с). С устойчивой токов (например, несколько секунд), агонистов может быть исключен из кончика быстрее, чем он может быть заменен путем диффузии из объема заполнения решение в микропипетки.

Потому что незначительный объем смещается с microiontophoresis, если он пытается изменить местных ионной среде (например, для доставки деполяризующего K ⁺ стимул), это не может быть эффективно достигнуто с microiontophoresis но легко достигается при давлении выброс жидкости в объеме оказывает желаемого композиции. Для местных стимуляции артериол, микропипетки советы с внутренним диаметром 2-3 мкм хорошо работать с выбросом давлением 4-5 МПа (28-35 кПа) и длительности импульса (например, 1 секунду) управляется с электромагнитного клапана ^10. Где устойчивой доставки агента из микропипетки на микрососудов требуется, давление выброса является предпочтительным использованием микропипетки соответствующих внутренним диаметром наконечника (например, ~ 10 мкм) ^11,12. Гидростатической колонки известных высота с клапаном крана обеспечивает недорогое, четко определенные включения / выключения постоянного напора давление. Расход определяется внутренний диаметр кончика пипетки и вождение давления. Как всегда, транспортное средство контроля необходимы для исключения неспецифической акции давления выброса.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Используемый Материал	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Боросиликатное стеклянные капилляры	Warner инструменты	GC120F-10
Горизонтальное Внесите Puller	Саттер инструменты	Модель P-97
Ацетилхолин хлорид	Sigma-Aldrich	A6625
Адаптер для Луер центр	Martech	AC1343	Для обеспечения микрокапиллярных трубы
0,2 мкм нейлон Titan фильтр	ВС Шри-	42204-НН	Низкий объем хранения для минимизации потерь
5 мл шприц	Becton Dickinson Ко-	309603
Внесите держатель	Warner инструменты	E45W-M12VH
Серебряные провода	Warner инструменты	AG10W	0,25 мм диаметр
3-осевой микроманипулятора	Сиския Дизайн Инструменты	DT3-100, MXB, MXC, МГБ / 8	Компоненты для манипулятора, как показано
microiontophoresis текущего программиста	Инструменты Всемирного Precision	Модель 260
запуска устройства	Обычай	обычай	Схема представлена ​​в Suppl. Рисунок 1
плита из нержавеющей стали	McMaster-Карр	1 / 8 "X 12" X 12 "	По проекту
Усиленный цифровой камеры	Стэнфордский Photonics Inc	XR/Mega-10	Интеграция с программным обеспечением управления Пайпер