Microiontophoresis e Micromanipolazione per intravitale Imaging di fluorescenza del microcircolo

Riepilogo

Microiontophoresis comporta movimento di ioni da una micropipetta in risposta ad una differenza di potenziale elettrico tra l'interno el'esterno della micropipetta. Molecole biologicamente attive sono quindi consegnati in proporzione alla corrente elettrica. Illustriamo microiontophoresis acetilcolina in collaborazione con micromanipolazione per studiare vasodilatazione endotelio-dipendente nel microcircolo.

Abstract

Microiontophoresis comporta passaggio di corrente attraverso una punta micropipetta per fornire un soluto in un luogo designato all'interno di una preparazione sperimentale. Microiontophoresis in grado di simulare la trasmissione sinaptica ¹ fornendo neurotrasmettitori e neuropeptidi sui neuroni riproducibile ^2. Volume non trascurabile (fluido) spostamento evita disturbo meccanico alla preparazione sperimentale. Adattare queste tecniche per la microcircolazione ³ ha attivato meccanismi di vasodilatazione e vasocostrizione da studiare a livello microscopico in vivo ^4,5. Uno dei principali vantaggi di tale erogazione localizzata è che permetta una reazione vasomotoria da studiare a siti definiti all'interno di una rete microvascolare senza evocare cambiamenti sistemici o riflessivo della pressione sanguigna e il flusso di sangue dei tessuti, rivelando così le proprietà intrinseche dei microvasi.

Una limitazione di microiontophoresis è che la concentrazione precisa di agenti consegnato al sito di interesse è difficile da accertare ^6. Tuttavia, la sua uscita dalla punta micropipetta è proporzionale alla intensità e la durata della espulsione attuale ^2,7, in modo tale che riproducibile stimolo-risposta può essere facilmente determinata nelle condizioni sperimentali ben definite (descritta sotto). Altri fattori influenzano la consegna microiontophoretic comprendono concentrazione di soluto e la sua ionizzazione in soluzione. Il diametro interno della punta micropipetta dovrebbe essere ~ 1 micron o meno di ridurre al minimo diffusionale 'fuga', che possono essere contrastati con una corrente di fissaggio. Così un verso l'esterno (positivo) di corrente viene utilizzato per espellere un catione e una corrente negativa utilizzata per conservarlo all'interno della micropipetta.

Fabbricazione di micropipette è facilitata con sofisticate estrattori elettronico ^8. Micropipette sono tirati da tubi di vetro capillari contenenti un filamento che la soluzione 'stoppini' nella punta della micropipetta quando riempito il back-end ("riempito"). Questo viene fatto inserendo un tubo microcapillare collegato ad una siringa contenente la soluzione di interesse e di espellere la soluzione nel lume della micropipetta. Micromanipolatori consentono il posizionamento desiderato delle micropipette all'interno della preparazione sperimentale. Micromanipolatori montato su una base mobile può essere posizionato intorno alla preparazione in base alla topografia della rete microvascolare (sviluppato sotto).

Il protocollo attuale dimostra microiontophoresis di acetilcolina (ACh ⁺ Cl ^-) su una arteriola della preparazione del mouse muscolo cremastere (Cfr. il protocollo: ID JOVE # 2874) per produrre vasodilatazione endotelio-dipendente. Consegna stimolo è sincronizzato con l'acquisizione di immagini digitalizzate mediante un trigger elettronico. L'uso di ^BAC-CX40 GCaMP2 topi transgenici ⁹ consente la visualizzazione delle risposte intracellulari di calcio sottostante vasodilatazione arteriolare in cellule endoteliali del microcircolo viventi.

Protocollo

1. Cura degli animali e Usa

A seguito di revisione e approvazione da parte della cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa, topi maschi di almeno 12 settimane di età sono utilizzati. Un mouse è anestetizzato con sodio pentobarbital (60 mg / kg) via intraperitoneale (ip) iniezione. In tutto gli interventi chirurgici ei protocolli sperimentali, l'anestesia è gestito da supplementi (10-20% di iniezione iniziale, ip), se necessario (ogni 30-60 minuti; indicato dal ritiro di risposta ai piedi, o stringere la coda). Dopo il completamento della procedura sperimentale, il mouse è sovradosaggio con pentobarbital (ip) e eutanasia da dislocazione cervicale.

2. Micropipette e Microiontophoresis

1. Micropipette Microiontophoresis (diametro interno punta, ~ 1 micron) sono preparati da tubi in vetro borosilicato capillare con un estrattore orizzontale pipetta. Il nostro è un 5 cono mm ~ per la rigidità; più coni sono più flessibili.
2. Micropipette sono riempito con 1M ACh (Figure1A-C) disciolto in acqua 18,2 MΩ. Per il riempimento, un tubo microcapillare è collegato al filtro da 0,2 micron accoppiato ad una siringa contenente l'agonista di interesse (Figura 1). Questi possono essere facilmente realizzati (vedi sotto) o acquistati dai fornitori commerciali. Il tubo microcapillare viene inserita nel back-end della soluzione micropipetta e ACh viene consegnato nel lume, mentre il ritiro del tubo microcapillare come la micropipetta riempie. Tenendo la micropipetta con la punta rivolta verso il basso, bolle d'aria vengono rimosse con delicatezza sfogliando la micropipetta.
3. La micropipetta è fissato in un supporto montato in un micromanipolatore (Figura 2). Il titolare ha un filo d'argento collega la soluzione ACh all'interno della micropipetta ad un pin esterno, che a sua volta è collegato al terminale positivo di un programmatore microiontophoresis. Un filo d'argento secondo depositati a bordo della preparazione dei tessuti è collegata al terminale negativo per completare il circuito, come la punta della micropipetta è avanzato nella soluzione fisiologica salina sopra la preparazione.
4. Una corrente mantenendo viene applicata per impedire la vasodilatazione (o risposta fluorescente), quando la punta micropipetta è posizionato adiacente alla parete arteriolare. Mantenendo corrente varia con le dimensioni della punta micropipetta (diametro interno = 1 micron) e la concentrazione agonista, ma è altamente riproducibile per i parametri definiti (usiamo ~ 200 nA per 1M ACh, 1 punta di micron). La corrente mantenendo cessa in coincidenza con la consegna di espulsione corrente tramite il grilletto elettronica (aggiuntiva Figura 1) sincronizzato con l'inizio di acquisizione delle immagini.

3. Micromanipolazione

1. Una piattaforma personalizzata per un portaoggetti XY è stato realizzato da ferromagnetici in acciaio inox. Dimensioni della piattaforma (1 / 8 "x 12" x 13 ") consentono di spazio sufficiente per micromanipolatori posizione intorno alla preparazione sperimentale Micromanipolatori desiderato (Figura 2A). Fissato alle basi magnetiche (Figura 2B) consentono il posizionamento come dettato dalla preparazione. Si tratta di posizionato direttamente sulla piattaforma fabbricato intorno alla preparazione per micropipette posizionamento in siti di interesse (Figura 2C).

4. Rappresentante Risultati

1. Con la punta della micropipetta in posizione adiacente ad una arteriola, non vi è risposta a fluorescenza per ACh (mantenendo quello attuale regolata per evitare perdite ACh). Sotto di una soglia di stimolo non c'era alcun effetto. Tuttavia, come intensità dello stimolo maggiore, del calcio delle cellule endoteliali fluorescenza maggiore a distanze progressivamente maggiore lungo le arteriole, così come l'intensità della fluorescenza nel sito di stimolazione (Figura 3).

Figura 1. Metodo per Riempimento Pipette Microiontophoresis. A) Un tubo microcapillare (freccia verde) è fissato in un raccordo a compressione (freccia blu) collegato a un filtro da 0,2 micron (freccia viola) che viene poi attaccato ad una siringa piena di 1M ACh. B) Il tubo microcapillare viene immessa nella pipetta microiontophoresis attraverso il back-end e la soluzione è spostato a riempire il lume della micropipetta. C) Una volta che la pipetta è riempito, tenere la punta verso il basso e leggermente sopra il cono flick per rimuovere le bolle (freccia nera).

Figura 2. Piattaforma personalizzate per il posizionamento Micromanipolatore. .. A) Una piattaforma ferromagnetici in acciaio inox è stato posizionato su un costume MVX10 base del microscopio contenente una fase traslazionale XY B) Circolare basi magnetiche apposta sul fondo della compatta a 3 assi micromanipolatori C) Micromanipolatori posizionati intorno alla preparazione sperimentale (vedi protocollo associato: JOVE ID # 2874) per studiare i siti di interesse specifico. Ilir dimensioni compatte e la versatilità permettono micropipette multiple per essere utilizzati contemporaneamente.

Figura 3. Fluorescenza di calcio nelle arteriole. Fluorescenza di calcio delle cellule endoteliali che rivestono la parete arteriolare aumenta con l'intensità dello stimolo. I primi 3 pannelli mostrato immagini di fluorescenza risposte alla A) 250 nA, B) 500 nA e C) 1000 eiezione nA di corrente (ogni 500 ms durata dell'impulso). La distanza a cui la fluorescenza del calcio delle cellule endoteliali aumento è indicato tra parentesi in AC (~ 130, 270 e 400 micron, rispettivamente). La linea di riferimento attraverso l'arteriola in ogni pannello indica dove le risposte fluorescenza (F / Fo) per ACh sono stati registrati presso il sito di stimolazione. D) Le registrazioni di F / Fo vs tempo per aumentare gli stimoli ACh. Come espulsione correnti è aumentato, F / Fo aumentati in ampiezza e durata. Si noti che 100 nA stimolo era al di sotto della soglia e non ha avuto effetto.

Supplementare Figura 1. Schema elettrico per innescare elettronici. Questo circuito è interfacciato con una porta parallela di un personal computer. Poi attivato, questo fornisce una costante TTL impulso di 5V. Il 7805 chip è un regolatore di tensione 5V collegato ad un 9-12V DC (una batteria di tensione appropriata è bene). Uscita dal 7805 fornisce l'alimentazione allo switch Quad bilaterali e con l'uscita del circuito. Ingresso ai capi della resistenza 1K è dal computer.

Discussione

Il protocollo qui descritto vengono utilizzati dei metodi di elaborazione e attuazione micropipette per microiontophoresis. Consegna di acetilcolina viene utilizzato per illustrare il calcio segnalazione sottostante vasodilatazione endotelio-dipendente nelle arteriole del mouse anestetizzato. I nostri risultati dimostrano che la distanza a cui ACh aumenta cellule endoteliali aumenta la fluorescenza di calcio con l'intensità di corrente di espulsione dal micropipetta microiontophoresis (Figura 3). Il mancato aumento della fluorescenza in condizioni di riposo indica perdita trascurabile di ACh dalla micropipetta. La mancanza di risposta a 100 nA intensità dello stimolo (Figura 3, la leggenda), mostra che una soglia di intensità di stimolazione è necessaria per il calcio delle cellule endoteliali ad aumentare. Queste tecniche possono essere facilmente adattato ad altri agenti vasoattivi e preparati tessuti.

Considerazioni di ordine pratico: in collaborazione con microiontophoresis per studiare la reattività arteriolare, molte cose devono essere riconosciuti. Mentre si è rivelato difficile determinare la concentrazione effettiva della agonista consegnato, stimolo-risposta curve sono riproducibili all'interno e tra i preparativi. Queste possono essere eseguite tenendo durata dell'impulso costante (ad esempio, 500 ms) e regolare la corrente di espulsione (ad esempio, 250, 500 e 1000 nA; Figura 3). In alternativa, l'espulsione di corrente può essere mantenuta costante (ad esempio, 500 nA) e durata dell'impulso varia (ad esempio, 250, 500 e 1000 ms). Per un riferimento alle azioni di una concentrazione definito agonista, la preparazione può essere superfused con la soluzione appropriata ^5. Poiché la forza trainante per l'espulsione soluto è movimento carica elettrica, l'agente da consegnare deve portare un onere netto per essere spostato dalla micropipetta. Per garantire che l'agente di interesse è la portatori di carica primaria, si scioglie ad alta concentrazione (ad esempio, 1 M per ACh) per minimizzare elettro-osmosi. Quando questo richiede manipolare il pH della soluzione di riempimento micropipetta, comandi del veicolo sono tenuti ad accertare eventuali effetti non specifici. Controlli appropriati dovrebbe essere eseguita anche per il passaggio di corrente da solo (ad esempio, usando micropipette riempite con soluzione salina isotonica). La distanza efficace per la diffusione dell'agente dal suo luogo di rilascio dovrebbe essere accertata ed è più facilmente determinata empiricamente dalla scomparsa di una risposta fisiologica (ad esempio, vasodilatazione o un aumento del calcio intracellulare su espulsione di ACh), come la micropipetta è posizionato al definito distanze dal sito di destinazione. In pratica, la distanza effettiva diffusione è fortemente influenzato da come la punta della micropipetta è posizionato nel tessuto, ad esempio, se la punta premuto nel tessuto e la sua punta è occluso, che l'espulsione è compromessa. Eccessiva del tessuto connettivo è particolarmente fastidioso e deve essere rimosso dalla superficie del tessuto durante la preparazione chirurgica. Bisogna anche tenere in considerazione la possibilità di esaurire la punta di un agente designato. Questo viene minimizzato l'uso di impulsi relativamente brevi (ad esempio, ≤ 1 s). Con correnti sostenute (ad esempio, alcuni secondi), l'agonista può essere espulso dalla punta più rapidamente di quanto può essere sostituito per diffusione dalla soluzione di massa compilando la micropipetta.

Perché il volume trascurabile è spostato con microiontophoresis, se si sta cercando di cambiare l'ambiente locale ionico (ad esempio, per fornire una K depolarizzante stimolo ^+), questo non può essere efficacemente realizzato con microiontophoresis ma è facilmente ottenuta con l'espulsione di pressione del liquido sfuso avere il desiderato composizione. Per la stimolazione locale di un arteriola, consigli micropipetta con diametro interno di 2-3 micron funzionano bene con la pressione di eiezione 4-5 psi (28-35 kPa) e durata dell'impulso (ad esempio, 1 secondo) controllata con una valvola a solenoide ^10. Qualora la consegna costante di un agente da una micropipetta su un microvasi è necessaria, l'espulsione di pressione è preferibile utilizzare micropipette di adeguati punta diametro interno (ad esempio, ~ 10 micron) ^11,12. Una colonna idrostatica di altezza noto con una valvola rubinetto fornisce un poco costoso, ben definito on / off testa pressione costante. Le portate sono determinate dal diametro interno del puntale e la pressione di guida. Come sempre, comandi del veicolo sono essenziali per escludere azioni aspecifiche di espulsione pressione.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Il materiale usato	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubi di vetro borosilicato Capillari	Warner Instruments	GC120F-10
Orizzontale Pipettare Puller	Sutter Instruments	modello P-97
Acetilcolina cloruro	Sigma-Aldrich	A6625
adattatore per Luer hub	Martech	AC1343	Per proteggere tubi microcapillare
0,2 micron nylon Titan filtro	Dom Sri	42204-NN	Volume di ritenzione basso per minimizzare la perdita di
Siringa da 5 ml	Becton, Dickinson Co.	309603
Pipetta Holder	Warner Instruments	E45W-M12VH
Filo d'argento	Warner Instruments	AG10W	Diametro di 0,25 millimetri
3-assi micromanipolatore	Siskiyou Progettazione Instruments	DT3-100, MXB, MXC, MGB / 8	Componenti per manipolatore come mostrato
microiontophoresis programmatore corrente	Mondo Strumenti di precisione	Modello 260
dispositivo di innesco	Costume	costume	circuitale fornito in Suppl. Figura 1
piastre in acciaio inox	McMaster-Carr	1 / 8 "x 12" x 12 "	Secondo il disegno
Intensificato Fotocamera Digitale	Stanford Photonics Inc	XR/Mega-10	Integrato con il software di controllo Piper