Microiontophoresis e Micromanipulação para imagens de fluorescência intravital da Microcirculação

Resumo

Microiontophoresis implica movimento de íons de uma micropipeta, em resposta a uma diferença de potencial elétrico entre o interior eo exterior da micropipeta. Moléculas biologicamente ativas são, assim, entregue em proporção à corrente elétrica. Nós ilustramos microiontophoresis acetilcolina em conjunto com micromanipulação para estudar vasodilatação dependente do endotélio na microcirculação.

Resumo

Microiontophoresis implica passagem de corrente por meio de uma micropipeta ponta para proporcionar um soluto em um local designado dentro de uma preparação experimental. Microiontophoresis pode simular ^uma transmissão sináptica através da apresentação de neurotransmissores e neuropeptídeos em neurônios reproducibly ^2. Volume negligenciável (líquido) de deslocamento evita distúrbio mecânico para a preparação experimental. Adaptar essas técnicas para a microcirculação ³ permitiu mecanismos de vasodilatação e vasoconstrição a ser estudada em nível microscópico in vivo ^4,5. Uma das principais vantagens do parto localizada como está permitindo respostas vasomotor a ser estudado em locais definidos dentro de uma rede microvascular sem evocar mudanças sistêmicas ou reflexa da pressão arterial e fluxo sanguíneo do tecido, revelando assim as propriedades intrínsecas de microvasos.

Uma limitação do microiontophoresis é que a concentração precisa de agente entregue no local de interesse é difícil verificar a ^6. No entanto, o seu lançamento a partir da ponta micropipeta é proporcional à intensidade e duração da ejeção do atual ^2,7, de modo que reprodutíveis relações estímulo-resposta pode ser facilmente determinada em determinadas condições experimentais (descritas abaixo). Fatores adicionais que afetam a entrega microiontophoretic incluem concentração de soluto e sua ionização em solução. O diâmetro interno da ponta da micropipeta deve ser ~ 1 mm ou menos para minimizar o 'vazamento' de difusão, que pode ser combatido com uma corrente de retenção. Assim, uma corrente (positiva) para fora é usada para ejetar um cátion e uma corrente negativa, utilizado para retê-lo dentro da micropipeta.

Fabricação de micropipetas é facilitada com puxadores sofisticados eletrônicos ^8. Micropipetas são extraídos de tubos capilares de vidro contendo um filamento que a solução "mechas" na ponta da micropipeta quando cheio de back-end ("preenchidos"). Isto é feito através da inserção de um tubo microcapilar conectado a uma seringa contendo a solução de interesse e solução de ejetar o para dentro do lúmen da micropipeta. Micromanipuladores permitir a colocação desejada de micropipetas dentro da preparação experimental. Micromanipuladores montado em uma base móvel pode ser posicionado em torno da preparação de acordo com a topografia das redes microvasculares (desenvolvido abaixo).

O presente protocolo demonstra microiontophoresis de acetilcolina (ACh ⁺ Cl ^-) em uma arteríola da preparação do músculo cremaster de rato (Veja associados protocolo: JOVE ID # 2874) para produzir vasodilatação dependente do endotélio. Entrega estímulo é sincronizada com a aquisição de imagens digitalizadas usando um disparador eletrônico. O uso de ^BAC-CX40 GCaMP2 ratos transgênicos ⁹ permite a visualização das respostas de cálcio intracelular subjacente vasodilatação arteriolar em células endoteliais na microcirculação vida.

Protocolo

1. Animal Care e Uso

Após análise e aprovação do Animal Care Institucional e Comitê Use, camundongos machos, pelo menos, 12 semanas de idade são usados. Um rato é anestesiados com pentobarbital sódico (60 mg / kg) via injeção intraperitoneal (ip). Ao longo de procedimentos cirúrgicos e protocolos experimentais, a anestesia é mantida por suplementos (10-20% da injeção inicial, ip), conforme necessário (a cada 30-60 minutos, indicado pela retirada de resposta aos pés ou beliscar a cauda). Após a conclusão do procedimento experimental o rato é uma overdose com pentobarbital (ip) e submetidos à eutanásia por deslocamento cervical.

2. Micropipetas e Microiontophoresis

1. Micropipetas Microiontophoresis (diâmetro da ponta interna, ~ 1 mm) são preparados a partir de tubos de vidro de borosilicato capilar utilizando um extrator de pipeta horizontal. Nossa tem um cone ~ 5 mm para a rigidez; tapers já são mais flexíveis.
2. Micropipetas são backfilled com 1M ACh (Figura 1A-C) dissolvida em 18,2 mohms água. Para aterro, um tubo microcapilar está conectado a 0,2 mM de filtro acoplado a uma seringa contendo o agonista de interesse (Figura 1). Estes podem ser facilmente fabricado (abaixo) ou adquiridos de fornecedores comerciais. O tubo microcapilar é inserido no back-end da solução micropipeta e ACh é entregue dentro do lúmen ao retirar o tubo microcapilar como a micropipeta enche. Segurando a micropipeta com sua ponta apontando para baixo, as bolhas de ar são removidas suavemente flicking a micropipeta.
3. A micropipeta é garantido em um suporte montado em um micromanipulador (Figura 2). O titular tem um fio de prata que liga o ACh solução dentro do micropipeta para um pino externo, que por sua vez está ligado ao terminal positivo de um programador microiontophoresis. Um fio de prata segundo garantiu à margem da preparação do tecido é conectado ao terminal negativo para completar o circuito com a ponta da micropipeta é avançada na solução salina fisiológica sobre a preparação.
4. Uma corrente de retenção é aplicado para evitar a vasodilatação (ou resposta fluorescente) quando a ponta da micropipeta é posicionado adjacente à parede arteriolar. Retenção atuais variam de acordo com o tamanho da ponta micropipeta (diâmetro interno = 1 mm) e concentração agonista, mas é altamente reprodutível para os parâmetros definidos (usamos ~ 200 nA para 1M ACh, uma dica mm). A corrente de retenção cessa coincidente com a entrega de ejeção atual via o gatilho eletrônico (Figura Suplementar 1) sincronizado com o início da aquisição da imagem.

3. Micromanipulação

1. Uma plataforma personalizada para um estágio do microscópio XY foi fabricado em aço inoxidável ferromagnéticos. Dimensões da plataforma (1 / 8 "X 12" X 13 ") permitem espaço suficiente para micromanipuladores posição em torno da preparação experimental como micromanipuladores desejado (Figura 2A). Garantidos para bases magnética (Figura 2B) permitir o posicionamento como ditado pela preparação. Estes são colocado diretamente sobre a plataforma feita em função da preparação para micropipetas posicionamento em sites de interesse (Figura 2C).

4. Resultados representante

1. Com a ponta micropipeta posicionado adjacente a uma arteríola, não há resposta de fluorescência para ACh (mantendo corrente do que ajustados para evitar vazamentos ACh). Abaixo de um limiar de estímulo não houve efeito. No entanto, como a intensidade do estímulo aumentava, fluorescência de cálcio das células endoteliais aumentou em distâncias progressivamente maior ao longo da arteríola, assim como a intensidade de fluorescência no local de estimulação (Figura 3).

Figura 1. Método para Backfilling Pipettes Microiontophoresis. A) Um tubo microcapilar (seta verde) é fixado em um encaixe de compressão (seta azul) conectada a um filtro de 0,2 mM (seta roxa), que é então anexado a uma seringa cheia de 1M ACh. B) O tubo microcapilar é alimentado no pipeta microiontophoresis através do back-end e solução é deslocado para preencher o lúmen do micropipeta. C) Uma vez que a pipeta está cheia, segure a ponta para baixo e suavemente dê pequenos toques acima do cone para remover as bolhas (seta preta).

Figura 2. Plataforma personalizado para Colocação micromanipulador. .. A) A plataforma de aço inoxidável ferromagnéticos foi colocado sobre uma base de microscópio personalizado MVX10 contendo um estágio de translação XY B) Circular bases magnética afixada na parte inferior do compacto de 3 eixos micromanipuladores C) micromanipuladores posicionado em torno da preparação experimental (Ver protocolo associado: JOVE ID # 2874) para estudar locais específicos de interesse. Oir tamanho compacto e versatilidade permitem micropipetas múltiplos sejam usados ​​simultaneamente.

Figura 3. Fluorescência de cálcio nas arteríolas. Fluorescência de cálcio das células endoteliais que revestem a parede arteriolar aumentou com a intensidade do estímulo. Os 3 primeiros painéis mostrado imagens de fluorescência para as respostas A) 250 nA, B) 500 nA e C) 1000 ejeção nA de corrente (todas as 500 ms duração do pulso). A distância a que fluorescence de cálcio das células endoteliais aumento é indicado por colchetes no AC (~ 130, 270 e 400 m, respectivamente). A linha de referência em todo o arteríola em cada painel indica onde as respostas de fluorescência (F / Fo) para ACh foram registrados no local da estimulação. D) As gravações de F / Fo versus tempo para estímulos aumentando ACh. Como de ejeção corrente aumentou, F / Fo aumentou em amplitude e duração. Note-se que 100 nA estímulo foi abaixo do limite e não teve efeito.

Figura suplementares 1. Diagrama de circuito para acionar eletrônico. Este circuito é conectado com uma porta paralela de um computador pessoal. Quando ativado ele fornece uma constante TTL pulso de 5V. O chip 7805 é um regulador de tensão 5V conectado a um adaptador de 9-12V DC (uma bateria de tensão adequada é bom). Saída do 7805 fornece energia ao Switch Quad bilaterais e à saída do circuito. De entrada através do resistor de 1K é a partir do computador.

Discussão

O protocolo aqui descrito demonstra métodos para preparação e execução de micropipetas para microiontophoresis. Entrega de acetilcolina é usado para ilustrar a sinalização de cálcio vasodilatação dependente do endotélio subjacente nas arteríolas do rato anestesiado. Nossos resultados mostram que a distância a que ACh aumenta célula endotelial aumenta a fluorescência de cálcio com a intensidade de ejeção atual da micropipeta microiontophoresis (Figura 3). A falta de aumento de fluorescência em condições de repouso indica fuga desprezível de ACh da micropipeta. A falta de resposta a 100 nA intensidade do estímulo (Figura 3, legenda) mostra que uma intensidade de limiar de estimulação é necessária para o cálcio das células endoteliais a aumentar. Estas técnicas podem ser facilmente adaptadas para outros agentes vasoativos e preparações de tecido.

Considerações de ordem prática: Ao trabalhar com microiontophoresis para estudar a reatividade arteriolar, várias coisas devem ser reconhecidos. Embora tenha sido difícil para determinar a concentração real de agonista entregue, estímulo-resposta curvas são reproduzíveis dentro e entre as preparações. Estes podem ser realizados mantendo a duração de pulso constante (por exemplo, 500 ms) e variando a ejeção de corrente (por exemplo, 250, 500 e 1000 nA; Figura 3). Alternativamente, de ejeção atual pode ser mantida constante (por exemplo, a 500 nA) e duração de pulso variável (por exemplo, 250, 500 e 1000 ms). Para uma referência para as ações de um agonista de concentração definida, a preparação pode ser superfused com a solução adequada ^5. Porque a força motriz para a ejeção de soluto é o movimento de carga elétrica, o agente a ser entregue deve carregar uma carga líquida a ser deslocados da micropipeta. Para garantir que o agente de interesse é o portador de carga primária, é dissolvido em concentração elevada (por exemplo, 1 M de ACh) para minimizar electro-osmose. Quando isso requer manipulação do pH da solução de enchimento micropipeta, comandos do veículo são obrigados a verificar a existência de efeitos não-específicos. Controles apropriados devem ser realizados para a passagem de corrente sozinho (por exemplo, usando micropipetas preenchido com solução salina isotônica). A distância efetiva de difusão do agente de seu local de libertação deve ser esclarecida e é mais prontamente determinada empiricamente pelo desaparecimento de uma resposta fisiológica (por exemplo, vasodilatação, ou um aumento de cálcio intracelular em cima de ejeção de ACh) como a micropipeta é posicionado no definidas distâncias do site de destino. Na prática, a distância de difusão efetivo é muito influenciada pela forma como a ponta da micropipeta é posicionado no tecido, por exemplo, se a ponta pressionado para baixo no tecido e sua ponta é ocluída, do que de ejeção é prejudicada. Tecido conectivo excessiva é particularmente problemático e deve ser removido da superfície do tecido durante a preparação cirúrgica. Atenção deve ser dada à possibilidade de esgotar a ponta do agente designado. Este é minimizado usando pulsos relativamente curto (por exemplo, ≤ s 1). Com correntes sustentada (por exemplo, alguns segundos), o agonista pode ser expulso da ponta mais rapidamente do que ele pode ser substituído por difusão a partir da solução a granel o preenchimento do micropipeta.

Porque o volume insignificante é deslocado com microiontophoresis, se alguém está tentando mudar o meio local iônicos (por exemplo, para entregar um K despolarizantes estímulo ^+), isso não pode ser efetivamente realizado com microiontophoresis mas é facilmente alcançada com ejeção pressão de fluido em massa tendo o desejado composição. Para a estimulação local de uma arteríola, dicas micropipeta com diâmetros internos de 2-3 mM trabalhar bem com a pressão de ejeção 4-5 psi (28-35 kPa) e duração do pulso (por exemplo, 1 segundo) controlada com uma válvula solenóide ^10. Se a entrega sustentada de um agente de uma micropipeta em um microvascular é necessária, de ejeção pressão é preferível usar micropipetas de diâmetro da ponta interna adequada (por exemplo, ~ 10 mm) ^11,12. Uma coluna hidrostática de altura conhecida com uma válvula torneira fornece um barato, bem definidas on / off carga de pressão constante. Taxas de fluxo são determinados pelo diâmetro interno da ponta da pipeta ea pressão de condução. Como sempre, os controles do veículo são essenciais para excluir ações inespecíficas de ejeção de pressão.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Usado	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Tubos de vidro de borosilicato capilar	Warner Instruments	GC120F-10
Horizontal Pipetar Puller	Sutter Instruments	modelo P-97
Cloreto de acetilcolina	Sigma-Aldrich	A6625
adaptador para Luer hub	Martech	AC1343	Para garantir tubulação microcapilar
0,2 m Nylon Titan filtro	Dom Sri	42204-NN	Volume de retenção baixa para minimizar a perda
Seringa de 5 ml	Becton-Dickinson Co.	309603
Titular da pipeta	Warner Instruments	E45W-M12VH
Fio de prata	Warner Instruments	AG10W	0,25 milímetros de diâmetro
3 eixos micromanipulador	Siskiyou design Instruments	DT3-100, MXB, MXC, MGB / 8	Componentes para manipulador, como mostrado
programador microiontophoresis atual	Precision Instruments mundo	Modelo 260
dispositivo de disparo	Personalizado	personalizado	circuito fornecido em Suppl. Figura 1
chapa de aço inoxidável	McMaster-Carr	1 / 8 "X 12" X 12 "	Acordo com o projeto
Intensificou Câmera Digital	Stanford Photonics Inc	XR/Mega-10	Integrado com software de Controle Piper