腭扩展口腔生物膜分析，荧光原位杂交和激光共聚焦显微镜

摘要

我们目前的协议矫治器的结构和成分分析的天然口腔生物膜与原位杂交（FISH）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）。口腔生物膜样品分别采自腭扩展，刮关闭其表面的丙烯酸树脂片和指分子处理。

摘要

天然异构生物膜共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）今天是促进全方位的染色技术，他们在荧光原位杂交^{（FISH）。1,2，}我们进行了试验研究，在口腔生物膜样品收集固定正畸（腭扩展）染色鱼，目的是评估天然生物膜和菌斑的堆积的三维^组织 。3,4鱼创造一个机会，在其本土生物膜环境染色细胞，使用荧光标记的16S rRNA的目标的探测^。4-7,19相比，替代技术，如免疫荧光标记，这是一种廉价，准确，直观的标记技术，以调查在混合生物膜财团不同^的细菌群体。18,20一般探头使用绑定到真细菌（ EUB338 + EUB338II + EUB338III以下EUBmix^），8-10厚壁菌门（LGC354交流;以下简称^{LGCmix），9,10}和杆菌^{（Bac303）11}此外，特异性探针结合变形链球菌 ^{（MUT590）12,13}和牙龈卟啉 ^{（POGI）13,14} 。极端的表面材料硬度（不锈钢和丙烯酸树脂）迫使我们准备生物膜找到新的途径。由于这些表面材料不能随时切用cryotome，各种抽样方法进行了探讨，以获得完整的的口腔生物膜。这些方法最可行的是在这个沟通。生物膜的丙烯酸树脂小片被刮掉，用无菌手术刀，注意不要破坏生物膜结构。镊子是用来收集从钢铁表面的生物膜。一旦收集到的样本是固定的，直接放在polysine镀膜玻璃幻灯片。这些幻灯片直接与探头米鱼entioned以上。各种鱼类协议相结合，并修改，以创建一个新的协议，很容易处理^{。5,10,14,15}随后共聚焦激光扫描显微镜分析样品。著名的配置^3,4,16,17可以可视化，包括蘑菇式地层和渠道弥漫的球状细菌群。此外，这些典型的生物膜结构的细菌组成进行了分析和创建二维和三维图像。

研究方案

1。标本采集

1. 口腔服务的4个月后取出固定腭扩展。使用NOLA旱地系统隔离，然后删除（图1和2）的家电。
2. 使用消毒的钳子，手套和托盘删除扩展，而不增加污染（图3和4）。
3. 在Sarstedt 120毫升小瓶存储对象在-20 ° C。在24小时内，取上冰和过程实验室。

2。生物膜固定

1. 刮去生物膜用无菌手术刀片，或收集用无菌镊子件。
2. 添加冰冷的4％PFA解决方案，直到样品覆盖。
3. 混合物孵育4℃（不冻结）3至12小时。较长的固定时间或固定温度较高，可能会导致透水性较弱的寡核苷酸探针的革兰阴性细胞的细胞信封。
4. 删除煤灰的解决方案，并用冰冷的1X PBS。重复此步骤2-3次为Remove残余煤灰。
5. 重悬样品1卷。冰冷的1X PBS和添加1卷。冰冷的96％（V / V）乙醇。
6. 样品存放于-20 ° C根据此协议，以固定的样本，可以存储几个月到几年。

3。固定样本脱水

1. 5-30μL载玻片PFA固定样本材料的应用。
2. 46干℃，约15分钟或更长的时间在房间温度。解冻溶菌酶和甲酰胺。
3. 加入250μL溶菌酶（1mg/ml的），在室温10分钟，从而促进局部破坏细胞壁进入细胞的探针的渗透。
4. DIP到50％，80％和96％（V / V）乙醇，每次3分钟的幻灯片。乙醇浓度系列的脱水作用，会瓦解的细胞膜。
5. 干在46℃10分钟的幻灯片。

4， 在原位杂交

1. 准备1毫升新鲜的杂交缓冲液（见表1浓度）。在这项研究中使用的甲酰胺浓度:10％（EUBmix），20％（Bac303，POGI，MUT590）或45％（LGCmix）。
2. 解冻寡核苷酸探针解决方案。在冰上解冻探头应保持和避光。
3. 添加2μL每个探头200μL杂交缓冲液，拌匀，适用于载玻片脱水样品的混合物。
4. 放入一个方形培养皿中一块纸巾，其余的杂交缓冲液倒到卫生纸。
5. 立即水平放置幻灯片入菜和关闭的菜。在烤箱放置在46℃1-5小时（90分钟就足够了，在大多数情况下）。作为水分室盘功能，防止从幻灯片杂交液的蒸发。特别是，甲酰胺的蒸发可引起非特异性探针对非靶细胞的结合。
6. 准备洗涤液50毫升（见表2 concentrations）。准备洗涤液50毫升管和预热至48℃水浴中。洗涤步骤是在48 ° C。
7. 删除幻灯片从杂交炉盘。立即洗掉的预热洗涤液的体积小，杂交缓冲液，并转移到剩余的洗涤液的幻灯片。
8. 将管含有洗涤液和幻灯片，在48℃水浴孵育10-15分钟。
9. 从管中取出幻灯片到冰冷的_{DDH 2} O为2-3秒，以消除残留洗涤液浸。
10. 空气干燥的幻灯片尽快（建议使用压缩空气）。快速干燥会降低探针的解离。
11. 干幻灯片可以存储在黑暗中，几个星期没有显著损失探头赋予的荧光信号在-20 ° C。

5。显微镜

1. 经过FISH和洗衣机，APPLY两滴antifadent密切幻灯片的左，右两端（冷冻切片应该到了这一步前加热到室温）。
2. 放置显微镜的盖玻片在上面，等到antifadent已蔓延在整个幻灯片。请注意，过量的antifadent显微镜图像模糊。
3. 配备适当的过滤器或激光器的激光扫描共聚焦显微镜下观察样本。我们使用的Leica TCS单位（HCX PL APO/63x:NA 1.2）。数据可以分析软件，如IMARIS或AMIRA。
4. 在antifadent嵌入的幻灯片，可以储存在4℃（不冻结）长达7天前探头赋予的荧光开始下降。另外，antifadent可以删除与DDH ₂ O，和干燥的幻灯片，可以长时间储存在-20 ° C。

6。代表性的成果:

刮关闭固定正畸的生物膜（图5）产生合适的薄片（图6），可直接上镜镀膜玻璃幻灯片杂交。通过这种方式，可以识别不同群体的orobiome细菌在其自然的三维环境，通过标记不同的标记的特异性探针（图7和图8）细菌的rRNA。在图7中，生物膜被染成EUBmix（绿色，所有的细菌）和LGCmix（黄色，厚壁菌门）。厚壁菌显示为绿色，因为他们是黄色和蓝色的染色。在图8中，生物膜被染成EUBmix（红色，所有的细菌），Bac303（蓝色，杆菌）和POGI（黄， 牙龈卟啉单胞菌 ）。 牙龈卟啉单胞菌是黄白色，所有三个探头绑定到其DNA和重叠结果在一个白色的信号颜色。也可以识别细菌群体之间形态上的差异（图9和10）。如图9所示，其中染色与EUBmix大型集群的球状细菌（绿色，所有的BActeria）。不同形状的口腔细菌，在图10中，球状和丝状菌可区分EUBmix（红）染色观察。此外，一个典型的蘑菇状的生物膜的结构，可以通过处理CLSM数据的三维模型（图11和12），点击这里观看影片的 3D建模。

图1。腭扩张器固定在原位 。

图2。诺拉干田制。

图3。消毒钳，手套和托盘。

图4。删除扩展。

图5。刮痧用无菌手术刀生物膜。

图6。树脂薄片直接杂交到镀膜玻璃幻灯片。

图7 CLSM的形象:一个特定的细菌群体的分化。 2D 3D CLSM堆栈数据覆盖。生物膜染色EUBmix（绿色，所有的细菌）和LGCmix（黄色，厚壁菌门）。

图8 CLSM的形象:一个特定的细菌群体的分化。 2D 3D CLSM堆栈数据覆盖。生物膜沾上EUBmix（红色，所有的细菌），Bac303（蓝色，Bacteroidetes）和POGI（黄， 牙龈卟啉单胞菌 ）。

图9 CLSM图像:具体形态分化。 2D 3D CLSM堆栈数据覆盖。 EUBmix沾上生物膜（绿色，所有的细菌）。球状​​细菌的大型集群（箭头）。

图10 CLSM图像:具体形态的分化。 2D 3D CLSM堆栈数据覆盖。 EUBmix生物膜染色（红色，所有的细菌）。球形（箭头低于）和丝状菌（箭头上述）可以区分。

图11。食用菌结构，从下面的三维视图。叠生物膜薄片（关闭矫治表面刮）EUBmix和proce染色，ssed与IMARIS（CLSM图像）。

图12:蘑菇结构，3D侧视图。堆栈的生物膜薄片加工IMARIS（CLSM图像）（关闭矫治表面刮）。

杂交缓冲液（200微升）
甲酰胺浓度	10％	20％	45％
5 M氯化钠	36	36	36
1米的Tris - HCl	4	4	4
2％SDS	1	1	1
足总杯	20	40	90
DDH 2 O	138	118	68
任何鱼探头	2	2	2

见表1。杂交缓冲液成分（μL浓度）。

洗涤缓冲液（50毫升）
甲酰胺浓度	10％	20％	45％
5 M氯化钠	4500	2150	300
1米的Tris - HCl	1000	1000	1000
0.5 M EDTA	0	500	500
DDH 2 Ø	44 500	46 350	48 200

表2。成分的洗涤液（μL浓度）。

电影1 点击这里观看影片。

讨论

此处描述的协议是一个非常可行的方法，从硬质材料的收集染色生物膜。采样和杂交是最关键的步骤。在采样过程中，必须小心收集足够厚度的切片，以确保生物膜的结构保持不变。在杂交过程中，它是必不可少的，以避免在温度的过度波动，从而避免了非特异性的约束力，或荧光标记的探针具有约束力的损失。这种鱼的协议是一种优雅的方法，直接染色玻片上不扰乱其组成正常的异构生物膜。幻灯片可以立即用于显微镜，而不需要再次移动样品。这样一来，对改善管染色是通过被应用于生物膜的剪切力。片> 50微米厚，可以以这种方式准备和调查。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotides	Target organism	Fluorochrome
EUB338 - 338III	Eubacteria	Cy3
LGC354 A-C	Firmicutes	FITC
Bac303	Bacteroidetes	Cy5
Mut590	Streptococcus mutans	FITC
POGI	Porphyromonas gingivalis	FITC

Component	Company	Comments
4% paraformaldehyde		4% solution in PBS
1 x PBS		3 x solution prepared
ddH2O	Millipore
Ethanol (100%)	Merck
Lysozyme	Roth	100 mg/ml stock solution
Formamide	Roth	99.5% solution
5 M NaCl	Roth
1 M Tris-HCl	Roth
2% SDS	Roth
FISH probes (oligonucleotides)	Invitrogen, Sigma
ProLong Gold antifadent	Invitrogen
Nail polish
Equipment
Incubator	Thermo Scientific
Water bath	IKA Tez
50 ml tubes	Sarstedt
Polysine-coated slides	Thermo Scientific