Oral Biofilm Analyse Palatal Expander durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung und konfokale Laser Scanning Mikroskopie

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll für die strukturelle und Analyse der Zusammensetzung der natürlichen oralen Biofilm aus kieferorthopädischen Apparaturen mit In situ Hybridisierung (FISH) und konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM). Oral Biofilm-Proben wurden von palatinal Expander gesammelt, Schaben Acrylharz-abplatzt ihrer Oberfläche und deren Weiterleitung für die molekulare Verarbeitung.

Zusammenfassung

Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) der natürlichen heterogenen Biofilm ist heute durch ein umfassendes Angebot an Färbetechniken, von denen einer Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) erleichtert. ^1,2 Wir haben eine Pilotstudie, in der mündlichen Biofilm Proben aus festen gesammelt wurden, kieferorthopädischen Apparaturen (palatinale Expander) wurden durch FISH mit dem Ziel, die dreidimensionale Organisation der natürlichen Biofilm und Plaque zu beurteilen gefärbt. ^3,4 FISH schafft eine Gelegenheit, um Zellen in ihrer Muttersprache Biofilm-Umgebung Fleck durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten 16S rRNA-Targeting-Sonden. ^4-7,19 Im Vergleich zu alternativen Techniken wie Immunfluoreszenz Kennzeichnung, ist dies eine kostengünstige, präzise und einfache Kennzeichnung Technik, um verschiedene bakterielle Gruppen in gemischten Biofilm Konsortien zu untersuchen. ^18,20 Allgemeine Sonden verwendet wurden, die Bindung an Eubakterien ( EUB338 + + EUB338II EUB338III; nachfolgend EUBmix), ^8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. Wurden nachfolgend LGCmix), ^9,10 und Bacteroidetes (Bac303) ¹¹ Darüber hinaus spezifische Sonden Bindung an Streptococcus mutans (MUT590) ^12,13 und Porphyromonas gingivalis (POGI) ^13,14 verwendet . Die extreme Härte der Oberfläche beteiligten Materialien (Edelstahl und Acryl) zwang uns, neue Wege zur Herstellung des Biofilms zu finden. Da diese Oberflächen-Materialien könnten nicht ohne weiteres mit einem Kryotom geschnitten werden, wurden verschiedene Methoden zur Probenahme untersucht werden, um intakte orale Biofilm zu erhalten. Die meisten praktikable dieser Ansätze ist in dieser Mitteilung vorgestellt. Kleine Flocken des Biofilms tragenden Acrylharz wurden mit einem sterilen Skalpell abgekratzt, kümmert sich nicht um den Biofilm-Struktur beschädigen. Pinzetten wurden verwendet, um Biofilm aus dem Stahl-Oberflächen zu sammeln. Einmal gesammelt, wurden die Proben fixiert und direkt auf Polysine beschichteten Glasplättchen gelegt. FISH wurde direkt auf diese Folien mit den Sonden m durchgeführtentioned oben. Verschiedene FISH-Protokolle wurden kombiniert und modifiziert werden, um ein neues Protokoll, das einfach zu handhaben war zu schaffen. ^5,10,14,15 Anschließend werden die Proben mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie analysiert. Namhafte Konfigurationen ^3,4,16,17 visualisiert werden, einschließlich Pilz-style-Formationen und Gruppen von Kokken durch Kanäle durchzogen. Darüber hinaus wurden die bakterielle Zusammensetzung dieser typischen Biofilm Strukturen analysiert und 2D-und 3D-Bilder erstellt.

Protokoll

1. Probengewinnung

1. Entfernen Sie feste palatinale Expander nach 4 Monaten von intraoralen Service. Verwenden Sie NOLA Dry Field System die Geräte, bevor Sie sie (Abbildungen 1 und 2) zu isolieren.
2. Gebrauch sterilisiert Zangen, Handschuhen und Trays zu Expander ohne Zugabe von Verunreinigungen (Abb. 3 und 4) zu entfernen.
3. Shop-Objekte in Sarstedt 120 ml Fläschchen bei -20 ° C. Nehmen Sie zum Labor auf Eis und Verfahren innerhalb von 24 Stunden.

2. Biofilm Fixierung

1. Abkratzen Biofilm Flocken mit einem sterilen Skalpell oder sammeln Stücke mit einer sterilen Pinzette.
2. Add eiskalte 4% PFA-Lösung bis die Probe gut bedeckt ist.
3. Inkubieren Sie die Mischung bei +4 ° C (nicht einfrieren!) Für 3 bis 12 Stunden. Längere Fixierung Zeiten oder höher Fixierung Temperaturen machen die Zellhüllen der gram-negativen Zellen weniger durchlässig für Oligonukleotid-Sonden.
4. Entfernen PFA-Lösung und Waschen mit eiskaltem 1X PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt 2-3 mal zu remove restliche PFA.
5. Resuspendieren der Probe in 1 vol. eiskaltes 1X PBS geben und 1 vol. eiskaltem 96% (v / v) Ethanol.
6. Lagern Sie die Proben bei -20 ° C. Proben fixiert nach diesem Protokoll kann für mehrere Monate bis Jahre gespeichert werden.

3. Die Dehydratisierung von festen Proben

1. Übernehmen 5-30 ul der PFA-fixierten Probenmaterials auf einen Objektträger.
2. Trocken bei 46 ° C für ca. 15 min oder bei Raumtemperatur länger. Tauwetter das Lysozym und das Formamid.
3. Add 250 ul Lysozym (1mg/ml) bei Raumtemperatur für 10 min und erleichtert so das Eindringen der Sonden in den Zellen durch die teilweise Zerstörung der Zellwände.
4. Dip Abgleiten in 50%, 80% und 96% (v / v) Ethanol für jeweils 3 min. Die entwässernde Wirkung der Ethanol-Konzentration Serie wird zerfallen die Zellmembranen.
5. Trocknen Sie die Objektträger bei 46 ° C für 10 min.

4. In-situ-Hybridisierung

1. Bereiten Sie 1 mlfrischen Hybridisierungspuffer (siehe Tabelle 1 für Konzentrationen). Formamid-Konzentrationen in dieser Studie verwendet: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, POGI, MUT590) bzw. 45% (LGCmix).
2. Auftauen Oligonukleotidsonde Lösungen. Aufgetaute Sonden sollten auf Eis gehalten werden und vor Licht geschützt.
3. Add 2 ul jeder Sonde zu 200 ul Hybridisierungspuffer, gut mischen und wenden Sie die Mischung auf die dehydrierte Probe auf einen Objektträger.
4. Legen Sie ein Stück Seidenpapier in eine quadratische Petrischale und gießen Sie die verbleibenden Hybridisierungspuffer auf die Tissue-Papier.
5. Anschließend wird der Objektträger horizontal in die Schüssel, und schließen Sie die Schüssel. Inkubieren in einem Ofen bei 46 ° C für 1-5 Stunden (90 min wird in den meisten Fällen genügen). Das Gericht fungiert als einer feuchten Kammer verhindert Verdunstung Hybridisierungslösung aus der Folie. Insbesondere kann die Verdunstung von Formamid verursachen unspezifische Sonde Bindung an Nicht-Zielzellen.
6. Bereiten Sie 50 ml Waschpuffer (siehe Tabelle 2 für concentrations). Bereiten Sie den Waschpuffer in einem 50 ml-Tube und Vorwärmung bis 48 ° C in einem Wasserbad. Der Waschschritt wird bei 48 ° C durchgeführt
7. Entfernen Sie die Schale mit der Folie aus der Hybridisierungsofen. Sofort abwaschen Hybridisierungspuffer mit einem kleinen Volumen von vorgewärmten Waschpuffer, und übertragen Sie die Folie in den verbleibenden Waschpuffer.
8. Das Röhrchen mit dem Waschpuffer und dem Schlitten zurück ins Wasserbad und Inkubieren bei 48 ° C für 10-15 min.
9. Entfernen Sie Folie aus der Tube und tauchen Sie ein in eiskaltem ddH ₂ O für 2-3 Sekunden, um restliche Waschpuffer zu beseitigen.
10. Der Luft trocknen die Folie so schnell wie möglich (die Verwendung von Druckluft wird empfohlen). Schnelle Trocknung reduziert Sonde Dissoziation.
11. Getrocknete Folien können im Dunkeln bei -20 ° C für mehrere Wochen gelagert, ohne signifikanten Verlust der Sonde-verliehenen Fluoreszenzsignal.

5. Mikroskopie

1. Nach FISH und Waschen apply zwei Tropfen antifadent in der Nähe der linken und rechten Ende eines Schiebers (gefroren Scheiben sollten auf Raumtemperatur erwärmt vor diesem Schritt werden).
2. Legen Sie ein Mikroskop Abdeckung auf der Oberseite gleiten und warten, bis die antifadent über die gesamte Folie ausgebreitet hat. Beachten Sie, dass eine übermäßige Menge an antifadent kann das mikroskopische Bild verwischen.
3. Beachten Sie die Proben unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit geeigneten Filtern oder Lasern ausgestattet. Wir verwendeten eine Leica TCS-Einheit (HCX PL APO/63x; NA 1,2). Die Daten können mit einer Software wie Imaris oder AMIRA analysiert werden.
4. Slides in antifadent eingebettet werden bei +4 ° C gelagert werden (nicht einfrieren) für bis zu 7 Tage vor der Sonde-verliehenen Fluoreszenz beginnt zu sinken. Alternativ kann die antifadent mit ddH ₂ O entfernt werden, und die getrockneten Objektträger können bei -20 ° C über einen längeren Zeitraum gelagert werden.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Scraping Biofilm aus festsitzenden kieferorthopädischen Apparaturen (Abbildung 5) ergibt geeignet Flocken (Abb. 6), die direkt auf beschichtete Objektträger für die Mikroskopie hybridisiert werden können. Auf diese Weise können verschiedene Gruppen von orobiome Bakterien in ihrer natürlichen dreidimensionalen Umgebung von Tagging bakterielle rRNA mit unterschiedlich markierten Sonden (Abb. 7 und 8) identifiziert werden. In Abbildung 7 wurde Biofilm mit EUBmix (grün, alle Bakterien) und LGCmix (gelb, Firmicutes) gefärbt. Firmicutes erscheinen in grün, wie sie mit gelben und blauen Flecken waren. In Abbildung 8 wurde Biofilm mit EUBmix (rot, alle Bakterien), Bac303 (blau, Bacteroidetes) und POGI (gelb, Porphyromonas gingivalis) gefärbt. Porphyromonas gingivalis in gelblich-weiß gezeigt wird, wie alle drei Sonden an die DNA binden und die Überlappung der Farben ergibt sich ein weißes Signal. Morphologischen Unterschiede zwischen Gruppen von Bakterien können auch identifiziert werden (Abb. 9 und 10). Große Cluster von Kokken sind in Abbildung 9, wo Färbung mit EUBmix durchgeführt wurde gezeigt (grün, alle bacteria). Verschiedene Formen von oralen Bakterien wurden visualisiert in Abbildung 10, wo coccoid und fadenförmige Bakterien durch Färbung mit EUBmix (rot) unterschieden werden können. Auch eine typische pilzförmige Struktur des Biofilms können über 3D-Modellierung der CLSM-Daten (Abbildungen 11 und 12) bearbeitet werden Klicken Sie hier, um einen Film von der 3D-Modellierung zu sehen.

Abbildung 1. Fester palatinale Expander in situ.

Abbildung 2. Nola Dry Field System.

Abbildung 3. Sterilisierte Zangen, Handschuhen und Fach.

Abbildung 4. Removed Expander.

Abbildung 5. Abschaben Biofilm mit einem sterilen Skalpell.

Abbildung 6. Resin Flocken direkt auf beschichtete Objektträger hybridisiert.

Abbildung 7 CLSM Bild:. Ausdifferenzierung eines bestimmten bakteriellen Gruppe. 2D-Überlagerung von 3D-CLSM-Stack-Daten. Biofilm gefärbt mit EUBmix (grün, alle Bakterien) und LGCmix (gelb, Firmicutes).

Abbildung 8 CLSM Bild:. Ausdifferenzierung eines bestimmten bakteriellen Gruppe. 2D-Überlagerung von 3D-CLSM-Stack-Daten. Biofilm gefärbt mit EUBmix (rot, alle Bakterien), Bac303 (blau, Bacteroidetes) und POGI (gelb, Porphyromonas gingivalis).

Abbildung 9 CLSM Bild:. Differenzierung von spezifischen Morphologien. 2D-Überlagerung von 3D-CLSM-Stack-Daten. Biofilm gefärbt mit EUBmix (grün, alle Bakterien). Große Cluster von Kokken (Pfeile).

. Abbildung 10 CLSM-Bilder: Differenzierung von spezifischen Morphologien. 2D-Überlagerung von 3D-CLSM-Stack-Daten. Biofilm gefärbt mit EUBmix (rot, alle Bakterien). Kokkoiden (Pfeil unten) und fadenförmige Bakterien (Pfeil oben) unterschieden werden kann.

Abbildung 11. Mushroom Struktur, 3D-Ansichten von unten. Stacks von Biofilm-Flocken (abgeschabt der Oberfläche eines kieferorthopädischen Gerätes), mit EUBmix und Verfahren angefärbtssed mit Imaris (CLSM-Bild).

Abbildung 12. Mushroom, 3D Seitenansicht. Stacks von Biofilm-Flocken (abgeschabt der Oberfläche eines kieferorthopädischen Gerätes) mit Imaris (CLSM Bild) verarbeitet.

Hybridisierungspuffer (200 ul)
Formamid-Konzentration	10%	20%	45%
5 M NaCl	36	36	36
1 M Tris-HCl	4	4	4
2% SDS	1	1	1
FA	20	40	90
DdH 2 O	138	118	68
Jede FISH-Sonde	2	2	2

Tabelle 1. Bestandteile des Hybridisierungspuffer (Konzentrationen in ul).

Waschpuffer (50 ml)
Formamid-Konzentration	10%	20%	45%
5 M NaCl	4500	2150	300
1 M Tris-HCl	1000	1000	1000
0,5 M EDTA	0	500	500
ddH 2 O	44 500	46 350	48 200

Tabelle 2. Inhaltsstoffe von Wasch-Puffer (Konzentrationen in ul).

Movie 1. Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.

Diskussion

Das Protokoll beschrieben ist eine sehr praktikable Ansatz zur Färbung Biofilme aus harten Materialien gesammelt. Sampling und Hybridisierung sind die wichtigsten Schritte. Bei der Probenahme ist darauf zu achten, dass Scheiben von ausreichender Dicke gesammelt werden, um sicherzustellen, dass der Biofilm-Struktur intakt bleibt. Während der Hybridisierung ist es wichtig, starken Temperaturschwankungen zu vermeiden, wodurch die unspezifische Bindung oder Verlust der Bindung, der fluoreszenzmarkierten Sonden. Diese FISH-Protokoll ist eine elegante Methode zur normalen heterogenen Biofilm direkt auf Glas-Objektträger Fleck ohne Unterbrechung seiner Zusammensetzung. Die Folien können sofort für die Mikroskopie, ohne die Notwendigkeit, die Probe erneut verschieben werden. Auf diese Weise ist eine Verbesserung gegenüber Färbung in Röhren von weniger Querkraft wird, um den Biofilm aufgebracht werden. Slices> 50 um dicke vorbereitet und auf diese Weise untersucht werden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotides	Target organism	Fluorochrome
EUB338 - 338III	Eubacteria	Cy3
LGC354 A-C	Firmicutes	FITC
Bac303	Bacteroidetes	Cy5
Mut590	Streptococcus mutans	FITC
POGI	Porphyromonas gingivalis	FITC

Component	Company	Comments
4% paraformaldehyde		4% solution in PBS
1 x PBS		3 x solution prepared
ddH2O	Millipore
Ethanol (100%)	Merck
Lysozyme	Roth	100 mg/ml stock solution
Formamide	Roth	99.5% solution
5 M NaCl	Roth
1 M Tris-HCl	Roth
2% SDS	Roth
FISH probes (oligonucleotides)	Invitrogen, Sigma
ProLong Gold antifadent	Invitrogen
Nail polish
Equipment
Incubator	Thermo Scientific
Water bath	IKA Tez
50 ml tubes	Sarstedt
Polysine-coated slides	Thermo Scientific