Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Protokol
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Ortodontik aletler doğal oral biyofilm yapısal ve kompozisyon analizi için bir protokol mevcut Yerinde Hibridizasyon (FISH) ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM). Oral biyofilm örnekleri kapalı akrilik reçine gevreği, yüzey kazıma ve moleküler işleme için onları yönlendiren, damak genişleticiler toplanmıştır.

Özet

Doğal heterojen biyofilm Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) onları situ hibridizasyon (FISH) floresan olma boyama teknikleri, geniş bir ürün yelpazesiyle bugün kolaylaştırmıştır. 1,2 oral biyofilm örnekleri sabit toplanan hangi bir pilot çalışma gerçekleştirilmiştir FISH, üç boyutlu bir organizasyon doğal biyofilm ve plak birikimi değerlendirmek için objektif ortodontik aletler (damak genişleticiler) ile boyandı 3,4 BALIK floresan etiketli 16S kullanımı ile kendi ana biyofilm ortamında hücreleri leke için bir fırsat yaratır rRNA hedef sondalar. 4-7,19 immunofluorescent etiketleme gibi alternatif teknikler karşılaştırıldığında, bu karma biyofilm konsorsiyumların içinde farklı bakteriyel gruplar araştırmak için ucuz, hassas ve basit etiketleme tekniği. 18,20 Genel problar kullanıldı Öbakteriler bağlamak ( EUB338 + EUB338II + EUB338III bundan EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC; bundan LGCmix), 9,10 ve Bacteroidetes (Bac303) 11. Buna ek olarak, Streptococcus mutans bağlanarak spesifik problar (MUT590) 12,13 ve Porphyromonas gingivalis (POGI) 13,14 . Katılan yüzey malzemeleri aşırı sertlik (paslanmaz çelik ve akrilik reçine), biyofilm hazırlanması için yeni yollar bulmak için bizi zorladı. Kriyotom ile bu yüzey malzemeleri kolaylıkla kesilebilir olamazdı olarak, sağlam sözlü biyofilm elde etmek için çeşitli örnekleme yöntemleri araştırıldı. Bu yaklaşımların en uygulanabilir, bu iletişimi sunulmaktadır. Biyofilm taşıyan akrilik reçine Küçük gevreği biyofilm yapısına zarar vermemeye dikkat ederek, steril bir bisturi ile kazınmış. Forseps çelik yüzeylerde biyofilm toplamak için kullanıldı. Bir kez toplanan numunelerin sabit ve polysine kaplı cam slaytlar doğrudan yerleştirildi. FISH probları m doğrudan bu slaytları yapıldıYukarıda entioned. Çeşitli BALIK protokolleri kombine ve kullanımı kolay yeni bir protokol oluşturmak için modifiye edilmiştir. 5,10,14,15 Daha sonra numuneler konfokal lazer tarama mikroskobu ile incelendi. Tanınmış yapılandırmaları 3,4,16,17 mantar tarzı oluşumlar ve kanallar tarafından kaplanır coccoid bakteri kümeleri dahil olmak üzere, görüntülenmiştir olabilir. Buna ek olarak, bu tipik biyofilm yapıların bakteriyel bir kompozisyon analiz ve 2D ve 3D görüntüler oluşturdu.

Protokol

1. Örnek toplama

  1. 4 ay sonra intraoral hizmeti sabit damak genişleticiler çıkarın. NOLA Kuru Alan Sistemi (Şekil 1 ve 2) çıkarmadan önce aletleri izole etmek için kullanın.
  2. Kontaminasyon (Şekil 3 ve 4) eklemeden genişleticiler kaldırmak için steril pense, eldiven ve tepsileri kullanın.
  3. -20 ° C'de Sarstedt 120 ml flakon Mağaza nesneleri 24 saat içinde laboratuvara buz ve süreç ele alalım.

2. Biyofilm fiksasyon

  1. Biyofilm gevreği steril bir bisturi ile kazıyın, veya steril forseps ile parçaları toplamak.
  2. Örnek kaplıdır kadar% 4 PFA çözüm buz ekleyin.
  3. Karışım +4 ° C'de 3 ila 12 saat boyunca (donma yok). Daha uzun fiksasyon kez veya daha fazla fiksasyon sıcaklıklarda oligonükleotid problar daha az geçirgen gram-negatif hücre hücre zarflar hale getirebilir.
  4. PFA çözüm çıkarın ve buz 1X PBS ile yıkayın. R bu adımı 2-3 kez tekrarlayınartık PFA aldır.
  5. 1 vol örnek süspanse edin. buz 1X PBS ve eklemek 1 vol. buz% 96 (v / v) etanol.
  6. -20 ° C'de örnek Mağaza Bu protokole göre sabit Örnekleri yıl birkaç ay saklanabilir.

3. Sabit Örnekler, Dehidrasyon

  1. Bir mikroskop lamı PFA sabit numune 5-30 ul uygulayın.
  2. Kuru 46 at ° C yaklaşık 15 dakika veya daha uzun süre oda sıcaklığında. Lizozim ve formamid çözülme.
  3. Böylece hücre duvarlarında kısmi yıkım tarafından problar hücre içine nüfuz kolaylaştırılması, 10 dakika oda sıcaklığında lizozim (1mg/ml) 250 ul ekleyin.
  4. % 50,% 80 ve% 96 (v / v) her biri 3 dakika etanol içine Lamı. Etanol konsantrasyonu serisi dehydrating etkisi, hücre zarları parçalanır.
  5. 46 ° C 'de 10 dakika süreyle slaytlar kurulayın.

4. In-situ hibridizasyon

  1. 1 ml hazırlayıntaze hibridizasyon tamponu (bkz. Tablo 1 konsantrasyonları için). Bu çalışmada kullanılan Formamid dağılımı:% 10 (EUBmix)% 20 (Bac303, POGI, MUT590) veya% 45 (LGCmix).
  2. Oligonükleotid prob çözümleri çözülme. Çözülmüş probları buz üzerinde tutulmalıdır ve ışıktan korunmalıdır.
  3. Her prob hibridizasyon tampon 200 ul 2 ul ekleyin, iyice karıştırın ve kurutulmuş örnek bir mikroskop lamı üzerine karışımı uygulayabilirsiniz.
  4. Kare bir Petri kabı içine, bir parça kağıt mendil koyun ve kalan hibridizasyon tamponu kağıt mendil üzerine dökün.
  5. Hemen yemeğin içine slayt yatay yerleştirmek ve tabak kapatın. 46 ° C'de 1-5 saat (90 dakika çoğu durumda yeterli olacaktır) bir fırında inkübe edin. Bir nem odası olarak çanak işlevleri slayt hibridizasyon çözüm buharlaşmasını önler. Özellikle, formamid, buharlaşma, non-spesifik prob bağlayıcı olmayan hedef hücreleri neden olabilir.
  6. 50 ml yıkama tamponu (bkz. Tablo 2 conce için hazırlayınntrations). 48 50 ml tüp ve ön ısıtma yıkama tamponu hazırlayın ° C su banyosunda. Yıkama 48 ° C yapılır
  7. Hibridizasyon fırın slayt çanak çıkarın. Hibridizasyon tamponu önceden ısıtılmış çamaşır tampon küçük bir hacmi ile hemen yıkayın ve yıkama tampon kalan slayt aktarmak.
  8. 48 ° C'de 10-15 dakika süreyle su banyosunda inkübe geri yıkama tampon ve slayt içeren tüp yerleştirin.
  9. Tüpten slayt çıkarın ve kalan yıkama tampon ortadan kaldırmak için 2-3 saniye boyunca buz gibi GKD 2 O içine batırın.
  10. Mümkün olduğunca çabuk slayt (basınçlı hava kullanılması tavsiye edilir) Hava kurulayın. Hızlı kuruyan prob disosiasyon azaltacaktır.
  11. Kurutulmuş slaytlar prob haiz floresan sinyal kaybı olmadan birkaç hafta, -20 ° C'de karanlıkta saklanabilir.

5. Mikroskopi

  1. Sonra FISH ve yıkama, Applantifadent yakın bir slaytın sol ve sağ uçları (dondurulmuş dilim bu adımı önce oda sıcaklığına kadar ısıtılmalıdır) y iki damla.
  2. Mikroskop kapağının üstünde kayma ve antifadent tüm slayt yayılmış kadar bekleyin yerleştirin. Antifadent aşırı miktarda mikroskopta görüntü bulanıklığını unutmayın.
  3. Uygun filtreler veya lazer ile donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskop altında örnekleri dikkate alınmalıdır. Biz Leica TCS birimi (HCX PL APO/63x, NA 1.2) kullanılır. Veriler, IMARIS veya AMIRA yazılım ile analiz edilebilir.
  4. Prob haiz floresan düşmeye başlamadan önce antifadent içinde gömülü Slaytlar +4 ° C (donma yok) 7 güne kadar saklanabilir. Alternatif olarak, antifadent GKD 2 O ile kaldırılır ve kurutulmuş slaytlar, uzun bir süre için -20 ° C'de saklanabilir .

6. Temsilcisi Sonuçlar:

(Sabit ortodontik aletler kapalı biyofilm KazımaŞekil 5), doğrudan mikroskopi için kaplı cam Slaytlarınıza melezleşmiştir olabilir uygun gevreği (Şekil 6) elde edilir. Bu şekilde, farklı etiketli spesifik problar (Şekil 7 ve 8) ile etiketleme bakteriyel rRNA orobiome bakterilerin farklı gruplar tarafından kendi doğal üç boyutlu ortamda tespit edilebilir. Şekil 7, biyofilm EUBmix (yeşil, tüm bakteriler) ve LGCmix (sarı, Firmicutes) ile boyandı. , Sarı ve mavi ile boyandı Firmicutes, yeşil görünür. Şekil 8, biyofilm EUBmix (kırmızı, bakteri), Bac303 (mavi, Bacteroidetes) ve POGI (sarı, Porphyromonas gingivalis) ile boyandı. DNA ve üst üste üç probları bağlamak Porphyromonas gingivalis, sarımsı beyaz gösterilir renkleri beyaz bir sinyal sonuçları. Bakteri grupları arasında morfolojik farklılıklar da tespit edilebilir (Şekil 9 ve 10). Coccoid bakteriler büyük kümeler (yeşil, tüm ba EUBmix ile boyama yapıldı Şekil 9 gösterilmiştircteria). Oral bakterilerin farklı şekiller coccoid ve ipliksi bakteri EUBmix (kırmızı) ile boyama ile ayırt edilebilir Şekil 10, görüntülendi. Ayrıca, biyofilm tipik bir mantar benzeri bir yapı, 3D modelleme, CLSM veri (Şekil 11 ve 12) ile işlenebilir 3D modelleme bir film izlemek için buraya tıklayın .

figure-protocol-6060
Şekil 1. in situ palatal genişletici düzeltildi.

figure-protocol-6233
Şekil 2 Nola Kuru Alan Sistemi.

figure-protocol-6380
Şekil 3 kerpeten, eldiven ve tepsi, sterilize edilmiştir .

figure-protocol-6554
Şekil 4. genişletici kaldırıldı.

figure-protocol-6702
Şekil 5 steril bir bisturi ile biyofilm kapalı Kazıma.

figure-protocol-6872
Şekil 6 Reçine gevreği doğrudan kaplı cam Slaytlarınıza melezleşmiştir.

figure-protocol-7059
Şekil 7 CLSM görüntü: farklılaşma belirli bir bakteri grubu. 3D CLSM veri yığınının 2B kaplama. Biyofilm EUBmix (yeşil, tüm bakteriler) ve LGCmix (sarı, Firmicutes) ile boyandı.

figure-protocol-7352
Şekil 8 CLSM görüntü: farklılaşma belirli bir bakteri grubu. 3D CLSM veri yığınının 2B kaplama. Biyofilm EUBmix (kırmızı, bakteri), Bac303 (mavi, Bacteroi ile boyanmışdetes) ve (sarı, Porphyromonas gingivalis) POGI.

figure-protocol-7692
Şekil 9 CLSM resim: özel morfolojileri farklılaşma. 3D CLSM veri yığınının 2B kaplama. Biyofilm EUBmix (yeşil, tüm bakteriler) ile boyandı. Coccoid bakteriler büyük kümeler (oklar).

figure-protocol-7989
Şekil 10 CLSM görüntüler: özel morfolojileri farklılaşma. 3D CLSM veri yığınının 2B kaplama. Biyofilm EUBmix (kırmızı, bakteri) ile boyandı. Coccoid (aşağıda ok) ve ipliksi bakteri (yukarı ok) ayırt edilebilir.

figure-protocol-8317
Şekil 11 Mantar yapısı, aşağıdan 3D görünümleri. EUBmix ve prosedür ile boyanan biyofilm gevreği (ortodontik cihaz yüzey kazınmalı), yığınlarIMARIS (CLSM resim) ile ssed.

figure-protocol-8605
Şekil 12 Mantar yapısı, 3D yan görünümü. IMARIS (CLSM resim) ile işlenmiş biyofilm gevreği (ortodontik cihaz yüzey kazınmalı) yığınlar.

Hibridizasyon tamponu (200 ul)
Formamid konsantrasyon % 10 % 20 % 45
5 M NaCl 36 36 36
1 M Tris-HCl 4 4 4
% 2 SDS 1 1 1
FA 20 40 90
GKD 2 O 138 118 68
Herhangi bir FISH probu 2 2 2

Tablo 1 hibridizasyon tamponu bileşenleri (ul konsantrasyonları).

Yıkama tamponu (50 ml)
Formamid konsantrasyon % 10 % 20 % 45
5 M NaCl 4500 2150 300
1 M Tris-HCl 1000 1000 1000
0.5 M EDTA 0 500 500
GKD 2 O 44 500 46 350 48 200

Tablo 2, yıkama tampon bileşenleri (ul konsantrasyonları) .

Film 1 film izlemek için tıklayınız.

Tartışmalar

Açıklanan protokol burada, sert malzemeler için toplanan boyama biyofilm yüksek uygulanabilir bir yaklaşımdır. Örnekleme ve hibridizasyon en kritik adımlar. Örnekleme sırasında, bakım, yeterli kalınlıkta dilimler biyofilm yapısı bozulmadan kalmasını sağlamak için toplanan alınmalıdır. Hibridizasyon sırasında, böylece kaçınarak, non-spesifik floresan etiketli probları bağlama, ya da bağlayıcı kaybı, aşırı sıcaklık dalgalanmaları önlemek için çok önemlidir. Bu BALIK protokol Bileşiminde bozmadan cam slaytlar doğrudan normal heterojen biyofilm leke zarif bir yöntemdir. Slaytlar hemen mikroskopi için bir kez daha örnek taşımak için bir gerek kalmadan kullanılabilir. Bu yolla, Tüplerde boyama üzerinde bir iyileşme biyofilm uygulanmakta olan daha az kesme kuvveti elde edilir. > 50 mikron kalınlığında Dilimleri Bu şekilde hazırlanan ve araştırılmalıdır.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu çalışma Hijyen Viyana Tıp Üniversitesi Graz tarafından desteklenmiştir. Tüm denekler bilgilendirilmiş onam verdi. Kurumsal çalışma protokolü ile ilgili onayı Üniversitesi Tıp Fakültesi Graz elde edildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
OligonucleotidesTarget organismFluorochrome
EUB338 - 338IIIEubacteriaCy3
LGC354 A-CFirmicutesFITC
Bac303BacteroidetesCy5
Mut590Streptococcus mutansFITC
POGIPorphyromonas gingivalisFITC

Table 3. Oligonucleotides (refer to probeBase13 for details).

ComponentCompanyComments
4% paraformaldehyde 4% solution in PBS
1 x PBS 3 x solution prepared
ddH2OMillipore 
Ethanol (100%)Merck 
LysozymeRoth100 mg/ml stock solution
FormamideRoth99.5% solution
5 M NaClRoth 
1 M Tris-HClRoth 
2% SDSRoth 
FISH probes (oligonucleotides)Invitrogen, Sigma 
ProLong Gold antifadentInvitrogen 
Nail polish  
Equipment  
IncubatorThermo Scientific 
Water bathIKA Tez 
50 ml tubesSarstedt 
Polysine-coated slidesThermo Scientific 

Table 4. Materials and equipment.

Referanslar

  1. Sunde, P. T. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth. Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).
  2. Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi. Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).
  3. Kolenbrander, P. E. Communication among oral bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).
  4. Zijnge, V. Oral biofilm architecture on natural teeth. PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).
  5. Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque. J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).
  6. Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. Bacterial interactions in dental biofilm development. J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).
  7. Jung, D. J. Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ. J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).
  8. Al-Ahmad, A. Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization. J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).
  9. Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).
  10. Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).
  11. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  12. Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber. Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).
  13. Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007. Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).
  14. Diaz, P. I. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).
  15. Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).
  16. Kolenbrander, P. E. Bacterial interactions and successions during plaque development. Periodontology. 42, 47-79 (2000).
  17. Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).
  18. Chalmers, N. I. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).
  19. Wecke, J. A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets. FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).
  20. Moter, A., Gobel, U. B. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 56floresan Yerinde HibridizasyonBALIKkonfokal lazer tarama mikroskobuCLSMortodontik aletleroral biyofilm

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır