通过显微注射介导的RNAi Necromenic线虫基因敲除和转基因 Pristionchus pacificus</em

摘要

在模式生物，转基因操纵基因的功能，而RNAi能够敲除特定的mRNA转录1-2。该协议的目的是为了说明需要稳定传输的DNA和瞬态双链RNA引入necromenic线虫技术 Pristionchus pacificus

摘要

虽然它是，越来越多的新兴模式生物实惠，进一步深入的基因功能和表达分析RNA干扰和稳定的转基因获得完全基因组测序仍然在许多物种由于特定的解剖和分子细胞生物学的有机体有限。例如，外冠集团线虫线虫 ^3，稳定传输的非线虫品种的转基因株系，其中包括没有在这似是而非的门（线虫）报道，除粪类 ^圆 线虫4 ^Pristionchus pacificus 5。为了方便的P.作用不断扩大pacificus的发展，演变和行为^6-7的研究，我们在这里描述当前用于显微注射转基因动物和基因敲除通过RNAi的方法。性腺一样的性腺pacificus合胞和能够纳入直接显微注射交付时的卵母细胞的DNA和RNA。不像C。线虫然而，稳定的转基因继承和躯体表达在体育pacificus需要的基因组与目标的转基因和共注射^标记 5的两端互补的核酸内切酶酶切的DNA自我此外。此外载体的基因组DNA是类似粪类圆线虫 ⁴和C 的生殖细胞转基因表达的要求线虫 。但是，目前尚不清楚如果自己的基因组DNA为动物的具体要求是因为体育pacificus SOMA是非常有效的，在沉默不复杂的多拷贝基因或染色体外体育阵列pacificus需要在有丝分裂过程中适当的动粒组装的基因组序列。两个武装（腹侧迁移didelphic）雌雄同体性腺进一步复杂化的能力， ^在 8个人蠕虫都注入生殖腺。我们也证明了利用显微注射，以击倒一个显性突变（滚子，tu92）由双链RNA（dsRNA）的注入性腺获得非滚动F ₁子代。不像C。线虫 ，但最喜欢的其他线虫， 体育pacificus PS312是不能接受系统性的RNAi通过喂养和浸泡，因此双链RNA必须注射到合胞性腺管理。在当前的研究中，我们希望描述的显微注射过程中， 需要变换PPA - EGL - 4启动子：：GFP融合的记者和击倒主导辊PRL - 1（tu92）突变的视觉信息的协议。

研究方案

1。转基因：DNA的制备

1. 占主导地位的合作注入标记：pRL3 [PPA - PRL - 1（ tu92）]
   pRL3质粒是一个占主导地位的合作注入的视觉识别的成功转型事件的标记。这种质粒编码为主导的PPA - PRL - 1基因密切相关的SQT - 1 C.胶原蛋白基因的突变等位基因 （ tu92） 线虫和野生型正弦运动转换成沿顺时针方向扭蠕虫的体轴^1,5的议案。转化的动物是非常相似流行的显性选择标记ROL - 6（su1006） 在 C在过去20年来的线虫。
2. 转基因目标记者：PPA - EGL - 4P：GFP
   有兴趣的基因可以与转录或翻译的GFP编码^序列 9 。在这项研究中，PPA - EGL - 4promoter：：GFP（EGL - 4的cGMP依赖的蛋白激酶）WAs一起使用，以确定是否2 kb的片段翻译起始的上游， 可以赋予P. GFP表达pacificus PS312。这GFP载体含有GFP的编码区与修改
   内含子和多用途PPA - RPL - 23的3'UTR结束符⁵请小月王和Ralf J.索默（马克斯-普朗克研究所，图宾根，德国，欧盟）提供。
3. 基因组DNA：PS312
   野生型体育此外pacificus PS312基因组DNA是需要获得稳定的转基因继承，特别是从转_基因 F 1动物的_F 2 ^后裔 5 。这是尚未确定，如果基因组DNA的形式复杂的额外染色体阵列与两个转基因（共注射标记PRL - 3和PPA - EGL - 4P：GFP记者） _类似稳定楼2转基因株系观察C。线虫 ^3。然而，要求基因组DNA和转基因份额identica升凝聚力出挑强烈建议形成复杂的额外染色体阵列宿主细胞可以识别传输正确的DNA（gDNA的准备使用西格玛G1N10试剂盒）。
4. DNA酶切
   用限制性内切酶线性的PPA - EGL - 4P：GFP载体DNA和生产兼容与合作注入标记pRL3和PS312的gDNA粘出挑。混合攻丝，不震荡。一小时在37 ° C。

pRL3	4微克
10xbuffer	10μL
PSTI（10 U /μL）	4μL
DH 2 O	〜
总计：	加入100μL
PPA - EGL - 4P：：GFP	4微克
10X缓冲	10μL
萨利（10 U /μL）	4μL
DH 2 O	〜
总计：	100μL
基因组DNA PS312	10微克
10X缓冲	10μL
的Pst I和Sal I（10 U /μL）	8μL
DH 2 O	〜
总计：	100μL

表1。限制性酶切混合物。

5. DNA沉淀和准备
   1. 1:10醋酸钠（3米NaCOOCH ₃ pH值5.2）和2.5倍体积的100％的乙醇来消化产品;增加20毫微克/糖原μL看到颗粒容易。
   2. 离心14000 RPM为15分钟，在4 ° C。
   3. 小费慢慢的离心管倒置，然后攻上纸巾，确保颗粒是安全的，在右下角管和乙醇倒出上清液。
   4. 加入1毫升75％的乙醇。
   5. 立即旋转14000转5分钟，在4 ° C。
   6. 慢慢引爆的离心管倒置，然后攻上纸巾，确保颗粒在右下角管安全和乙醇倒出上清液。
   7. 干颗粒在真空离心14,000 5分钟的转速在25-30 ° C，直到干燥和完全不含乙醇。
   8. 添加30μLTE或无菌DH _2℃前一个旋涡混合简要留在4℃过夜。
   9. 表2描述了如何创建从每个注射纯化的DNA注射液。
   10. 贮存于-20 ° C在解冻后的混合物jection，降速在5分钟14,000 RPM管摆脱碎片微粒可能阻塞注射针头。

遗传物质	集中
PPA - EGL - 4P：：GFP（贝）	> 5 ng /μL的（0.1-10ng/μl）
pRL3（PSTI）	> 1纳克/μL
基因组DNA PS312（PSTI +贝）	> 60毫微克/μL
DH 2 O	〜
总计：	30μL

表2。PPA - PRL - 1注射的混合物

2。 RNA干扰：在体外双链RNA的合成

1. 使用PCR扩增感兴趣的基因。 RHL091 agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC - 5' - 3'BamHI位（网站）和RHL092 5' - tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG - 3“（PSTI网站）用于扩增一个464 bp的基因片段，从pRL3含有PPA - PRL - 1（tu92）等位基因向量（位置3-466 ）。
2. 用BamHI和PstI消化的PCR产物。
3. 结扎片段BamHI位/ PSTI消化pL4440 RNAi的喂养载体^2。
4. 主管细胞转换成插入载体和增长氨苄青霉素的LB媒体板（50微克/毫升）。
5. 选择经PCR成功插入载体，使用的T7引物。
6. 使用两侧的T7 PCR产物含有PRL - 1基因，使双链RNA双链RNA）使用块的IT RNAi的合成试剂盒（Invitrogen公司）。
7. dsRNA的浓度是最好的，如果> 200纳克/μL，最高可达1微克/μL注射。
8. 贮存于-20 ° C解冻后的混合物注射，5分钟降速管摆脱碎片微粒可能阻塞注射液在14000转ñ针。

3。显微注射：注射转基因和/或双链RNA协议

1. 注射针头
   1. 设置Narishige针拔取器（型号：PC - 10）的温度：
      1. 底部的旋钮转到“2号取暖器。”
      2. 打开“第二加热器ADJ。”直到面板旋钮读取55.0-60.0 ° C的长短不一的锥形针头。
   2. 底部旋钮转到“步骤1”（在一个步骤中提取的针）。
   3. 负载针进入会议厅，并确保它是安全的。
   4. 按“开始”按钮（红色按钮），并允许所有的权重（这应该使两个相反的方向相同的针）拉针。
   5. 从担保播放，卫生署，以防止灰尘积累针在塑料培养板腔和存储针。
2. 安装垫
   1. 在1.5 ml离心管，使2％的崇高的琼脂solution的宝琼脂加入0.02克至1毫升H _{2 O}琼脂可以保存于4 ° C的一年。
   2. 调匀融化在热块琼脂设置为> 88 ° C。
   3. 用1毫升的微管，置于载玻片中间的液体高贵的琼脂2％的下降（费舍尔，12 - 544 - F）。
   4. 拼合由另一载玻片放置在顶部的下拉。
   5. 直到有一层五载玻片重复“落步”。
   6. 删除每个玻片上滑动的玻璃幻灯片交相辉映。
   7. 干扁平化玻片上的琼脂板在真空烘箱在70 ° 4小时至过夜C（或在室温下过夜）。
   8. 多次注射垫和存储以供将来使用。
3. 微量注射雌雄同体性腺

图1。对体育的一个示意图pacificus ANATomy。明确的有核细胞是女性生殖细胞（卵母细胞）和灰色阴影部分是肠道。所示，但只有一个远端前性腺通知远端的两个性腺跨近中期体对方背部。

图2。显微注射的图片（一）注射针头的重点是与拉毛细管件行权。轻轻抚摸该边针的针尖，针尖应打破，同时仍​​保留了尖锐点。 （二）进入前针插入性腺只是第一次注射的肠道曲率以上。 （三）进入底部的针插入性腺略低于肠道曲率，第二次注射。

3. 1. 确保对比度和DIC的剪切设置查看雌雄同体性腺的理想选择。
   2. 1.0-2.0μL的注射液混合装入拉升毛细管针。
   3. 放置在操纵的显微注射针;氮气罐的压力表应设置为0.5-1秒（10-20 psi）的理想条件。
   4. 针尖突破稍微触摸到一个薄拉到的毛细管管放在幻灯片（图2A）边缘。
      1. 针断路器幻灯片：最薄的部分，一把拉住毛细管置于载玻片上一滴油
   5. 针一旦被打破，它可以在空闲的位置，而你挑你的蠕虫垫（P. pacificus注射他们干出前5分钟的窗口和死亡）。
   6. 使用全板的J4年轻成虫，倒入足够的石蜡油（重），以刚好盖住OP50细菌草坪中的所有蠕虫。
   7. 选择一个蠕虫病毒和它放置在注射垫。
   8. 显微镜蠕虫将载玻片;位置蠕虫的性腺针的方向和需要远离外阴LE（图2B，2C）。
   9. 显微镜视图的位置，下针。
   10. 顶部性腺在同一焦平面（图2B）和针的位置。
   11. 轻轻捅蠕虫和泵注射液; ooctyes对远端尖端分离表明一个成功的注射（优化转基因或双链RNA传递，你应该看到注射后的扩张在继续，直到它向远端的性腺波TIP）。
   12. 重新定位较低的性腺和重复注射针注入，但是由于性腺是卵母细胞的扩散将是不可见的肠道，从而更难以实现（图2C）。
   13. 正常的蠕虫表明注射后成功注入，不应该有任何损坏的生殖腺（凸出外阴或体腔内部弹出）。
   14. 放置在怠速位置退针。
   15. 准备救援蠕虫。
   16. 添加M9的缓冲区下降到注入蠕虫是放在垫（0.5μL）。
   17. 使用，你挑一些OP50细菌，触摸与OP50的蠕虫，应该坚持。我们不使用吸管口。
   18. 放置到钢板接种50μL点OP50的蠕虫病毒，2-4蠕虫等板块可以获救。
4. 注射后的存储和转基因的筛选
   1. 商店注入蠕虫_（0）20 ° C〜4天产卵和成长起来的F _1。
   2. 第四天为选定的表型转基因， 表达PPA - PRL - 1显性标记的滚动动物的搜索屏幕上的画面蠕虫。
   3. 选择单一独立的，与所观察到的表型到新的种子板块_和存储F 1“在25秒动物° C，这个温度鼓励形成稳定的线_从 F 1 '号
   4. 从独立的F ₁线的单_F 2 。个别F ₂ 行也有类似的基因传输速率。我们经常获得> 15楼₂线每改造F ₁动物。
   5. 在25 ° C存储后代
   6. 轧辊的传输速率通常保持不变后的_{F 4}代，因此它是在这个时候需要确定的目标基因的表达水平（PPA - EGL - 4P：GFP：）为每个行。 GFP的表达可能不占主导地位的滚子表型的显性程度的关联。
5. 注射后的存储和RNAi的表型的筛选
   1. 商店注入蠕虫_（0）20 °〜4天，奠定和_成长 F 1 C 。
   2. 屏幕的F ₁第四天蠕虫选定的表型（RNAi技术敲除表型，可能在我们的情况与目标基因的活性损失， 损失PPA - PRL - 1的表型渗透剂的表型搜索屏幕）。
   3. 根据我们的经验，非辊击倒表型丢失> 97％的F _2。

4。代表性的成果：

1。结果，转基因

会议	注射P 0	F 1压路机	％转基因F 2	后楼2％的平均传输
1	60	2	（1）0％ （2）13％	不适用 13％± 10
2	40	1 *	（3）0％	不适用
3	40	0	0％	不适用
4	40	1	（4）0％	不适用
5	20	0	0％	不适用
6	40	1	（5）26％	22％± 10

*男性辊没有交叉; NA：不适用

：GFP（萨尔I酶切），pRL3（滚子）（PST我消化）和基因组DNA PS312（PstI和SalI酶切）：PPA - EGL - 4P注入PS312结果见表3。

图3（a）野生型（乙，丙）稳定的F ₄ pRL3; PPA - EGL - 4P：：GFP转基因线显示头部神经元GFP表达。

2。 RNA干扰的结果

图4。核糖核酸注射PRL - 1突变体显示完整击倒。“滚动式”运动（一）PRL - 1的滚筒增益功能突变 tu92 。 （二）“撞倒”PRL - 1突变体表现出正常的野生型的姿势和运动。 （三）注入PRL - 1（底部）也有更长的身体比PRL - 1突变体（顶部）。 （四）注射PRL - 1（底部）身体也比野生型PS312（顶部）。更长的身体表型中也观察到的ROL - 5（SQT - 1）的RNAi敲除的 C. 线虫氮气（数据未显示）。

	滚	非卷
一个PRL - 1双链RNA（200纳克/微升）	13	21
乙PRL - 1双链RNA（1000纳克/μL）	9	16
控制	20	2

表4。 摘要PPA - PRL - 1双链RNA注射。 （一）[双链RNA] = 200毫微克/μL;（二）[双链RNA] = 1000纳克/微升。 P = Fisher精确检验，双尾，为200和1000 ng /μL的注射，分别为0.0019和0.041。

讨论

P. pacificus人群中找到全球各种金龟子甲虫物种的密切联系，是一个模型之间的自由生活线虫和寄生线虫中间。 体育的力量作为一个新兴的模式生物pacificus在其遗传和物理图谱，促进不偏不倚正向遗传筛选分离突变体的位置映射整合打下（即不只是以前线虫为特征的^候选基因）6,10。然而，C线虫基因技术是不会轻易转让给体育pacificus由于显著?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
产品名称：	产品编号：	供应商：
DMI3000注射显微镜	DMI3000	徕卡
微量操纵器（直接驱动）	Narashige BC - 3球联合	Tritech研究
针拖轮	Narashige的PC - 10	Tritech研究
微量™全数字多压力系统	Narashige MINJ - D	Tritech研究
GeneElute™哺乳动物的基因组DNA小量试剂盒	G1N70	西格玛
pJet克隆喷射套件	K1231	Fermentas公司
GeneJET质粒小量制备试剂盒	K0502	Fermentas公司
DNA清洁浓缩™	D4005	ZYMO研究
BLOCK - IT™的RNAi TOPO ®转录试剂盒	K3500 - 01＆K3650 - 01	Invitrogen公司
DIFCO™琼脂高贵	DF0142 - 15 - 2	费舍尔Scientifi
显微镜盖玻片（1.5 - 0.160.19毫米厚;尺寸：50 x 45毫米）	12 - 554 - F	Fisher Scientific则
玻璃毛细管（长丝）	615000	上午系统
石蜡油（重）	O122 - 1	Fisher Scientific则
KH 2 PO 4	P386 - 500	Fisher Scientific则
NA 2 HPO 4	AC20651 - 5000	Fisher Scientific则
氯化钠	BP3581	Fisher Scientific则
硫酸镁	M80 - 500	Fisher Scientific则