RNAi는 Necromenic 선충류의 Microinjection에 의해 유전자 최저 및 Transgenesis을 중재 Pristionchus pacificus</em

요약

RNAi는 특정 mRNA의 성적 1-2 최저 수있을 때 모델 생물에서 transgenesis는 유전자 기능을 조작할 수 있습니다. 이 프로토콜은 necromenic 선충류에 안정적으로 전송 DNA와 과도를 두 번 좌초 RNA를 소개하는 데 필요한 기술을 설명하는 것을 목표로 Pristionchus pacificus 진화 발달, 행동 생물학의 연구.

초록

그것은 RNA 간섭하고 안정적​​인 transgenesis에 의해 유전자의 기능과 표현 분석 - 깊이에서 추가, 완전히 합성 genomes를 얻을 특정 해부와 유기체의 분자 세포 생물학으로 인해 많은 종류에 제한 남아 있습니다.하는 새로운 모델 생물에 대해 점점 더 저렴한 있지만 예를 들어, 안정되지 않은 Caenorhabditis 종의 유전자 변형 라인을 전송 Caenorhabditis elegans ³ 포함 왕관 그룹 Caenorhabditis 외부 Strongyloides stercoralis ⁴ Pristionchus pacificus ^5를 제외하고,이 그럴듯한 문 (Nematoda)에보고되지 않았습니다. P.의 역할 확대를 촉진하기 위해 개발, 진화, 그리고 행동 ^6-7의 연구 pacificus, 우리는 여기에 유전자 변형 동물과 gene RNAi에 의해 아래로 노크를 만드는 microinjection을 사용하는 현재의 방법을 설명합니다. 의 생식​​선과 마찬가지로 P.의 생식선 pacificus은 syncitial 직접 microinjection에 의해 전달되는 oocytes에 DNA와 RNA를 통합이 가능합니다. C. 달리 P.의 elegans 그러나 안정 transgene 상속 및 체세포 표현 pacificus은 대상 transgenes 및 coinjection 마커 ⁵ 끝까지 보완 endonucleases와 소화 자기 게놈의 DNA를 추가할 필요합니다. 캐리어 게놈의 DNA의 Strongyloides stercoralis 또한 ^4와 C의 배아 세포에서 transgene 표현에 대한 요구 사항과 비슷합니다 elegans. 동물들의 자신의 게놈의 DNA에 대한 특정 요구 사항이있는 경우 그러나, 그것은 명확하지 않기 때문에 P. pacificus 소마이 아닌 복잡한 다중 복사 유전자를 입을 또는 매우 효율적입니다 P.에 extrachromosomal 배열 pacificus은 유사 분열하는 동안 적절한 kinetochore 조립에 대한 게놈 시퀀스가 필요합니다. 두 무장 (의 복부 마이 그 레이션광고에 나온것에 didelphic) 생식선 추가 개별 웜 ⁸ 양쪽 생식선을 삽입하는 능력을 복잡. 우리는 또한 최저의 비 롤링 F ₁ 자손을 얻기 위해 생식선에 두 번 좌초 RNA (dsRNA)를 주사하여 지배적인 돌연변이 (롤러, tu92)에 microinjection의 사용을 보여줍니다. C. 달리 elegans지만, 대부분의 다른 nematodes처럼, P. pacificus PS312은 먹이와 몸으로 따라서 dsRNA가 syncitial 생식선에 microinjection에 의해 관리되어야합니다 통해 체계적 RNAi에 수용하지 않습니다. 현재이 연구에서 우리는 PPA - egl - 4 모터를 변환하는 데 필요한 microinjection 과정을 설명하도록하겠습니다 : : GFP에 융합 기자와 최저의 지배 롤러 prl - 1 (tu92) 시각 정보를 프로토콜에 돌연변이.

프로토콜

1. Transgenesis : DNA의 준비

1. 지배적인 공동 사출 표시 : pRL3 [PPA - prl - 1 (tu92)]
   pRL3 플라스미드 시각 성공적으로 변환 이벤트를 식별을위한 지배적인 공동 분사 마커입니다. 이 플라스미드는 밀접 C.에있는 sqt - 1 콜라겐 유전자와 관련된 PPA - prl - 1 유전자의 돌연변이 allele 지배 (tu92)에 대한 인코딩 elegans와 벌레의 몸은 축 ^1.5을 따라 시계 방향으로 왜곡 움직임에 wildtype sinusoidal 운동을 변환합니다. 변형 동물은 C.에 사용되는 인기있는 지배적인 선택 마커 rol - 6 (su1006)과 매우 유사 지난 20 년 동안 elegans.
2. 대상 기자 transgene : PPA - egl - 4P : : GFP
   관심 유전자는 순서 ⁹ 코딩 GFP에 transcriptionally 또는 translationally 연결될 수 있습니다. 본 연구에서는 PPA - egl - 4promoter : GFP (egl - 4, cGMP 의존 단백질 키나제)이 사용되었습니다번역의 시작 상류 2 이하 단편은 P.의 GFP 발현을 부여 할 수있다면 D는 확인하기 pacificus PS312. 이 GFP 벡터 수정된와 GFP 코딩 영역이 포함되어 있습니다
   introns 및 다목적 PPA - RPL - 23 친절 Xiaoyue 왕과 랄프 J. 서머 (최대 - 플랑크 연구소, Tuebingen, 독일, EU)에서 제공하는 3 'UTR 터미네이터 ^5.
3. 게놈 DNA : PS312
   wildtype P.의 추가 pacificus PS312의 게놈의 DNA는 특히 자신의 _F이 자손 ⁵ 유전자 변형 F _한 동물에서 안정적인 transgene 상속을 얻기 위해 필요합니다. 안정 F ₂ 유전자 변형 라인에서 관찰 비슷한 : 게놈 DNA가 두 transgenes (GFP 기자 : 공동 분사 마커 pRL - 3과 PPA - egl - 4P)로 복잡한 추가 염색체 배열을 형성하는 경우는 아직 확실하지 않습니다 C. elegans ^3. 그러나, 요구 사항은 동일한 cohesi를 공유할 수있는 게놈 DNA와 transgenes을적 overhangs 강력 호스트 세포가 적절한 DNA 전송 (gDNA는 시그마 G1N10 키트를 사용 준비)를 인식할 수 복잡한 추가 - 염색체 배열의 형성을 제안합니다.
4. DNA의 소화
   : GFP 벡터 DNA와 공동 분사 마커 pRL3과 PS312 gDNA와 호환 끈적끈적한 overhangs를 생성하려면 다음과 같이 제한 효소는 PPA - egl - 4P을 linearize하는 데 사용됩니다. vortexing하지, 도청으로 섞는다. 37 한 시간 동안 품어 ° C.

pRL3	4 μg
10xbuffer	10 μl
PstI (10 U / μl)	4 μl
DH 2 O	~
총 :	100 μL
PPA - egl - 4P : : GFP	4 μg
10X 버퍼	10 μl
SalI (10 U / μl)	4 μl
DH 2 O	~
총 :	100 μl
gDNA PS312	10 μg
10X 버퍼	10 μl
PST I 및 샐 I (10 U / μl)	μl 8
DH 2 O	~
총 :	100 μl

표 1. 제한 효소 다이제스트를위한 혼합.

5. DNA의 석출 및 준비
   1. 1시 10분 아세트산 나트륨 (3 M NaCOOCH ₃ 산도 5.2)와 소화에 제품에 100 % 에탄올의 2.5X 볼륨을 추가, 펠렛을 쉽게 볼 수 20 NG / 글리코겐의 μl를 추가합니다.
   2. 4 15 분 동안 14,000 rpm으로 원심 ° C.
   3. 티피로 뜨는을 가만히 따르다천천히 NG 원심 튜브 거꾸로 후, 티슈에 감청 펠렛은 튜브의 하단 모서리에 안전 있는지와 에탄올 무료 제작.
   4. 75 % 에탄올 1 ML을 추가합니다.
   5. 즉시 4 5 분간 14,000 rpm으로 회전 ° C.
   6. 천천히 거꾸로 원심 튜브를 팁 다음 펠렛은 튜브의 하단 모서리에 안전 있는지와 에탄올 무료 만드는 조직 종이에 그것을 감청하여 뜨는을 가만히 따르다.
   7. 25-30에서 5 분간 14,000 rpm으로 진공 원심 분리기에 드라이 펠렛 ° C, 건조하고 에탄올의 완전 무료까지.
   8. TE 또는 멸균 DH ₂ O 30 μl를 추가하고 ° C 믹싱 잠시 전에 와동 4에서 하룻밤 둡니다.
   9. 표 2는 분사 각 정화 DNA에서 사출 혼합물을 만드는 방법을 설명합니다.
   10. -20 ° C.에 저장 주사에 대한 혼합물을 해동 후, 수 파편 입자를 제거하기 위해 5 분간 14,000 rpm으로 튜브를 다운 스핀주사 바늘을 방해할.

유전 물질	집중
PPA - egl - 4P : GFP (SalI)	> 5 μl / NG (0.1-10ng/μl)
pRL3 (PstI)	> 1 NG / μl
gDNA PS312 (PstI + SalI)	> 60 NG / μl
DH 2 O	~
총 :	30 μl

표 2. PPA - prl - 1 사출 혼합물

2. RNA 간섭 : 체외 더블 좌초 RNA 합성에

1. 관심의 유전자를 증폭하기 위해 PCR을 사용합니다. RHL091 5' - agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC - 3 '(BamHI 사이트) 및 5' - RHL092 tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG - 3'(PstI 사이트)가 464 BP의 게놈의 파편을 증폭하는 데 사용되었다PPA - prl - 1 (tu92) allele을 포함하고있는 pRL3 벡터에서 ment (위치 3-466).
2. BamHI과 PstI로 PCR 제품을 다이제스트.
3. BamHI / PstI pL4440 RNAi 수유 벡터 ² 소화하기 위해 조각을 Ligate.
4. 관할 세포에 삽입된 벡터를 변환하고 암피실린 LB 미디어 플레이트 (50 μg / ML)에 그들을 성장.
5. T7 primers를 사용하여 PCR하여 성공적으로 삽입 벡터를 선택합니다.
6. BLOCK - IT RNAi 합성 키트 (Invitrogen)를 사용)를 두 번 좌초 RNA dsRNA를 만들기 위해 prl - 1 유전자를 포함하는 PCR 제품을 어귀 T7을 사용합니다.
7. 경우 dsRNA 농도는 가장 최대 1 μg / μl 주입에 대한> 200 NG / μl.
8. -20 ° C.에 저장 주사에 대한 혼합물을 해동 후 주사 바늘을 방해할 수 파편 입자를 제거하기 위해 5 분간 14,000 rpm으로 튜브를 다운 스핀.

3. Microinjection : transgenes 및 / 또는 dsRNA의 주입을위한 프로토콜

1. 주입 바늘
   1. 온도 : Narishige 바늘 풀러를 (PC - 10 모델 #) 설정
      1. 에 아래 손잡이를 돌려 "2 번 히터."
      2. "제 2의 히터 형용사를."회전 패널 때까지 손잡이는 55.0-60.0을 읽고 ° C 길이를 변화의 테이퍼 니들 팁하십시오.
   2. (한 번에 주사를 했었어요) "1 단계"로 다시 아래쪽 손잡이를 돌립니다.
   3. 의회에 바늘을로드하고 안전한지 확인하십시오.
   4. '시작'버튼 (빨간 버튼)을 누르면 바늘이 모든 가중치 (이것은 반대 방향으로 두 개의 동일한 바늘을 만들어야합니다)를 뽑아 될 수 있습니다.
   5. 바늘에 축적에서 먼지를 방지하기 위해 플레이 - Doh로 장소에 안전하게 플라스틱 문화 접시에있는 챔버와 가게에서 바늘을 제거합니다.
2. 마운트 패드
   1. 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에서 H ₂ O. 1 ML에 귀족 한천의 0.02 g를 추가하여 2 % 한천 귀족의 솔루션을 한천은 ° C 년간 최대 4에 저장할 수 있습니다.
   2. 철저하게 믹스 앤> 88 ° C.로 설정된 열 블록에 한천을 녹여
   3. 1 ML micropipette 사용 (피셔, 12-544 - F) 유리 슬라이드의 중간에 액체 2퍼센트 귀족 한천의 드롭을 배치.
   4. 드롭 위에 또 다른 유리 슬라이드를 삽입하여 평평하게.
   5. 다섯 유리 슬라이드의 레이어가있을 때까지 "드롭 단계"를 반복합니다.
   6. 유리 슬라이딩하여 각 유리 슬라이드를 제거하는 것은 서로 떨어져 슬라이드.
   7. 70 진공 오븐에 유리 슬라이드에 한천 패드를 평평하게 건조 ° 하루 4 시간 동안 C (또는 실온에서 하룻밤).
   8. 나중에 사용하기 위해 다중 사출 패드하고 저장하십시오.
3. hermaphroditic 생식선에 Microinjection

그림 1. P.의 구조 도면 pacificus의 해부학. 맑은 nucleated 세포가 여성의 배아 세포 (oocytes)과 회색 음영 부분의 대장입니다. 오직 한 말초 앞쪽에 생식선이 표시됩니다하지만 두 말초 생식선 중순 시체 근처 dorsally 서로 교차 확인할 수 있습니다.

그림 2. microinjection의 이미지. (A) 주사 바늘 끝이 가져온 모세관 조각의 맨 오른쪽 라인 초점을 맞추고 있습니다. 여전히 날카로운 지점을 유지하면서 가볍게 그 가장자리에 바늘의 팁을 감동으로 바늘 끝은 휴식한다. (B) 상단에 바늘 삽입은 첫 번째 주사에 대한 창자의 곡률 위에 생식선. (C) 아래로 바늘을 삽입 두 번째 주사에 딱 내장 곡률 아래 생식선.

3. 1. 명암과 전단 DIC 설정 남녀 추니 생식선을 볼 이상적입니다 있는지 확인하십시오.
   2. 뽑아 모세관 바늘로 주입 혼합물의 1.0-2.0 μl를로드합니다.
   3. microinjection의 조작하는 사람에 바늘을 장소, 질소 탱크의 압력 게이지가 이상적인 조건을 설정해야합니다 (10-20 PSI0.5-1 초)을.
   4. 슬라이드 (그림 2A)에 위치 얇게 뽑아 모세관 튜브의 가장자리에 약간 그것을 만져 바늘 끝을 깰.
      1. 니들 차단기 슬라이드 : 가져온 기름 한 방울의 유리 슬라이드에 배치 모세관의 얇은 부분
   5. 바늘이 부러되면 (P. pacificus들은 드라이 아웃하기 전에 주사를위한 5 분 창을 가지고 다이) 패드로 벌레를 선택하는 동안 그것은 유휴 위치에 자리 수 있습니다.
   6. J4 - 젊은 성인 웜 가득 접시를 사용하여 OP50 세균 잔디에있는 모든 벌레를 커버 단지 충분한 파라핀 오일을 (무거운) 부어.
   7. 벌레를 선택하고 사출 패드에 놓으십시오.
   8. 위치 바늘과 거리 바늘 (그림 2B, 2C)에서 산문의 방향으로 벌레의 생식선, 현미경에 웜에 유리 슬라이드를 놓습니다.
   9. 현미경보기의 위치에 바늘을 낮춥니다.
   10. 같은 초점 평면 (그림 2B)에서 최고의 생식선과 바늘을 위치.
   11. 부드럽게 벌레를 찌를와 사출 혼합물의 펌프, 말초 팁으로 분리 ooctyes은 (transgene 또는 dsRNA 전달을 최적화하기 위해 성공적인 주입을 나타냅니다, 당신은 주사시 이것은 말초 가까이 때까지 계속 생식선의 확장의 물결을 볼 수 팁).
   12. 아래 생식선과 반복 주사로 주입 바늘을 조정,이 생식선은 oocytes의 확산을 볼 수 없습니다 용기를 아래에 있으며 (그림 2C) 달성 따라서 더 어렵습니다 그러나 때문이다.
   13. 일반 찾고 웜은 주사 후 성공적으로 주사를 나타냅니다, (산문에서 밖으로 튀어나온 또는 신체 캐비티 내부 쫌) 손상 생식선 없을 것입니다.
   14. 유휴 위치에 바늘을 돌려 놓습니다.
   15. 벌레를 구출하기 위해 준비합니다.
   16. 주입된 벌레가 위치 패드에 M9 버퍼의 한 방울 (0.5 μl)를 추가합니다.
   17. 귀하의 선택에 몇 가지 OP50 박테리아를 사용하여 OP50과 벌레를 터치하고, 그것은 스틱해야합니다. WE는 입을 피펫을 사용하지 마십시오.
   18. OP50 50 μl 명소와 씨앗을 접시에 벌레를 놓으십시오, 2-4 웜는 같은 접시에 구조될 수 있습니다.
4. Transgenesis에 대한 사후 분사 스토리지 및 심사
   1. 상점 20시 (P ₀₎ 벌레를 주입 ° C 알을 낳기와 F ₁ 자라 ~ 4 일 동안.
   2. 선택한 표현형 (PPA - prl - 1 지배적인 마커를 표현 압연 동물 transgenesis, 검색 화면)에 대한 네 번째 날에 화면 웜.
   3. 하나의 독립 F ₁ 선택 '25 새로운 씨앗 판 및 저장하기 위해 관찰과 표현형의 동물 ° C,이 온도가 F _1에서 안정적인 라인의 형성 격려's을 (를)
   4. 독립 F ₁ 라인에서 싱글 F _2. 개별 F ₂ 라인은 비슷 transgene 전송 속도 있습니다. 우리는 종종> 15 얻을 변형 F _한 동물 당 F ₂ 라인.
   5. 25 ° C.에 후속 세대를 저장
   6. 각 라인에 대한 : 롤러의 전송 속도는 대개 따라서 그것은 대상 transgene의 표현 수준을 (GFP : PPA - egl - 4P) 결정하기 위해이 시간에 필요합니다, F ₄ 세대 이후 지속적으로 남아 있습니다. GFP 표현은 지배 롤러 표현형의 penetrance의 범위와 연관되지 않을 수 있습니다.
5. RNAi의 phenotypes에 대한 사후 분사 스토리지 및 심사
   1. 상점 20시 (P ₀₎ 벌레를 주입 ° C 누워 F ₁ 성장할 ~ 4 일 동안.
   2. 화면 F 선택한 표현형 (RNAi의 최저의 표현형, PPA - prl - 1 표현형의 손실의 경우, 대상 유전자 활동의 손실과 관련있을 수 있습니다 penetrant phenotypes에 대한 검색 화면)에 대한 네번째 일 ₁ 웜.
   3. 우리의 경험에서가 아닌 롤러 최저의 표현형은 F _2> 97%에서 손실됩니다.

4. 대표 결과 :

Transgenesis의 P "> 1. 결과

세션	P 0 주입된	F 1 롤러	% F 유전자 변형이	F 2 이후 평균 % 전송
일	60	이	(1 호선) 0 % (라인 2) 13%	NA 13% ± 10
이	40	1 *	(3 행) 0 %	NA
3	40	0	0%	NA
4	40	일	(4 호선) 0 %	NA
5	20	0	0%	NA
6	40	일	(5 호선) 26%	22% ± 10

내용 "> 크로스 않았 * 남자 롤러, NA : 해당 사항 없음

: GFP (SAL 나는 소화), pRL3 (롤러) (PST 나는 소화) 및 gDNA PS312 (PstI 및 SalI이 소화). PPA - egl - 4P로 주입 PS312의 표 3 결과.

그림 3 (A) wildtype (B, C) ​​안정 F ₄ pRL3, PPA - egl - 4P :. : 머리 신경 세포 GFP 발현을 보여주는 GFP 유전자 변형 라인.

2. RNA 간섭의 결과

그림 4. RNA는 prl - 1 돌연변이가 "롤링"운동의 완전한 분해를 보여줍니다. (A) prl - 1 롤러 이득의 기능 돌연변이 tu92을 주입. (B) prl - 1 돌연변이 전시 정상 wildtype의 자세와 운동 "을 무너 뜨 렸어." (C) prl - 1 (바닥)도이 이상 B 약이라고 속이고보다 ody prl - 1 돌연변이 (위). (D) 주입 prl - 1 (하단)의 긴 본문 wildtype PS312 (위) 이상도있다. 더 이상 신체 표현형 또한 rol - 5 C.의 (sqt - 1) RNAi의 최저에서 관찰되었다 elegans N2 (데이터가 표시되지 않음).

	롤	비 롤
prl - 1 dsRNA (200 μl / NG)	13	21
B prl - 1 dsRNA (μl / NG 1000)	9	16
제어	20	이

표 4. PPA - prl - 1 dsRNA 주사의 요약. (A) [dsRNA] = 200 μl / NG, (B) [dsRNA] = 1000 μl / NG. P = 각각 200 1000 μl / NG 주사에 대한 두 개의 꼬리 피셔의 정확한 테스트,,,에 의해 0.0019 및 0.041.

토론

P. pacificus의 인구는 전세계 다양한 풍뎅이 딱정벌레의 종들과 긴밀한 연관에서 발견 무료 생활 기생 nematodes 사이의 중간 모델 선충류집니다. P.의 강도 새로운 모델 유기체로 pacificus은 불편 앞으로 유전 화면에서 격리 돌연변이의 위치 매핑을 증진의 유전자와 물리적지도의 통합에 누우면 (즉,뿐만 아니라 이전에 C. elegans의 특징 후보 유전자에 대한) ^6,10. ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
제품 :	카탈로그 # :	공급 :
DMI3000 사출 현미경	DMI3000	Leica
Microinjector를 조작하는 사람 (직접 운전)	Narashige BC - 3 볼 조인트	Tritech 연구
니들 풀러	Narashige PC - 10	Tritech 연구
MicroInjector ™ 모든 - 디지털 다중 압력 시스템	Narashige MINJ - D	Tritech 연구
GeneElute ™ 포유류의 게놈 DNA Miniprep 키트	G1N70	시그마
pJet 복제 제트 키트	K1231	Fermentas
GeneJET 플라스미드 Miniprep 키트	K0502	Fermentas
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나이 HPO 4	AC20651 - 5000	피셔 과학
NaCl	BP3581	피셔 과학
MgSO 4	M80 - 500	피셔 과학