RNAi опосредованного Нокдаун гена и трансгенез по Микроинъекция в Necromenic нематода Pristionchus расШсиз</em

Резюме

В модельных организмов, трансгенез может манипулировать функций генов в то время как РНК-интерференции может нокдаун конкретных стенограммы мРНК 1-2. Этот протокол направлен на иллюстрации методов, необходимое для внедрения стабильно передается ДНК и переходные двухцепочечной РНК в necromenic нематоды Pristionchus расШсиз Для исследований в эволюционной, развития и поведенческих биологии.

Аннотация

Хотя это и более доступными для новых модельных организмов для получения полной последовательности генома, дальнейшего углубленного функции гена и выражения анализов, РНК-интерференция и стабильной трансгенез остается ограниченным во многих видов из-за особенности анатомии и молекулярной клеточной биологии организма. Например, за пределами Caenorhabditis корону группа, которая включает Caenorhabditis Элеганс ^3, стабильно передается трансгенных линий, не связанных с Caenorhabditis видов не было зарегистрировано в этом благовидный типу (нематод), за исключением Strongyloides stercoralis ⁴ и Pristionchus расШсиз ^5. Чтобы облегчить расширение роли П. расШсиз в изучении развития, эволюции и поведения ^6-7, мы описываем здесь современные методы использовать микроинъекции для создания трансгенных животных и генной сбить путем РНК-интерференции. Как гонад P. расШсиз является syncitial и способных включения ДНК и РНК в ооцитах при доставке прямой микроинъекции. В отличие от С. Элеганс однако, стабильное наследование трансгенов и соматических выражение в П. расШсиз требует добавления собственной геномной ДНК переваривают эндонуклеазами дополнением к концам целевой трансгенов и инжекции маркеры ^5. Кроме того носителя геномной ДНК похожа на требование для экспрессии трансгена в Strongyloides stercoralis ⁴ и в половых клетках C. Элеганс. Тем не менее, не ясно, если специальные требования для животных собственной геномной ДНК происходит потому, что П. расШсиз сома очень эффективно глушителей несложных мульти-копии генов или что внехромосомными массивы в P. расШсиз требуют геномных последовательностей для правильной сборки кинетохор во время митоза. Вентральной миграции двуруком (didelphic) гонад у гермафродитов еще более усложняет возможность вводить и половых желез в отдельных червей ^8. Мы также демонстрируют использование микроинъекции в нокдаун доминирующим мутант (ролик, tu92) путем введения двухцепочечной РНК (дсРНК) в гонадах получить не-подвижного F ₁ потомства. В отличие от С. Элеганс, но как и большинство других нематод, П. расШсиз PS312 не восприимчивы к системным RNAi через кормление и замачивания и, следовательно, дсРНК должны управлять микроинъекции в syncitial половых желез. В этом текущем исследовании, мы надеемся, чтобы описать процесс микроинъекции, необходимых для преобразования PPA-EGL-4 промоутера:: GFP репортер слияния и нокдаун доминирующим ролик ПРЛ-1 (tu92) мутант в визуально информативные протокола.

протокол

1. Трансгенез: ДНК подготовки

1. Доминирующие совместно инъекций маркера: pRL3 [PPA-ПРЛ-1 (tu92)]
   PRL3 плазмиды доминирующей совместно инъекции маркер для визуального выявления успешных событий трансформации. Эта плазмида кодирует доминирующие мутантный аллель (tu92) из PPA-ПРЛ-1 ген тесно связан с SQT-1 коллагена гена C. Элеганс и превращает дикого типа синусоидальной передвижения по часовой стрелке в скручивания движений вдоль тела червя оси ^1,5. Преобразовано животных очень похожа на популярный доминирующим маркер выбора РОЛ-6 (su1006), используемые в С. Элеганс за последние 20 лет.
2. Целевая репортер трансгенов: PPA-EGL-4p:: GFP
   Интересующего гена могут быть связаны или транскрипционно трансляционно для GFP кодирующей последовательности ^9. В этом исследовании, PPA-EGL-4promoter:: GFP (EGL-4, цГМФ зависимой протеинкиназы) было использоватьг, чтобы определить, 2 кб фрагмент перед началом перевода может даровать GFP выражение в П. расШсиз PS312. Этот вектор содержит GFP GFP кодирующей области с измененными
   интроны и многоцелевой PPA-RPL-23 3 'УТР терминатор ⁵ любезно предоставлены Xiaoyue Ванг и Ральф Дж. Соммер (Max-Planck Institute, Тюбинген, Германия, ЕС).
3. Геномная ДНК: PS312
   Добавление дикого типа П. расШсиз PS312 геномной ДНК необходима для получения стабильного наследования трансгена, в частности, от трансгенных животных F ₁ на их потомство F ₂ ^5. Пока еще не уверен в том, геномной ДНК образует сложные дополнительные хромосомные массивов с двумя трансгенов (совместно инъекций маркера ПРЛ-3 и PPA-EGL-4p:: GFP репортер), аналогичные тем, которые наблюдаются в стабильных F ₂ трансгенных линий в C. Элеганс ^3. Тем не менее, требование о геномной ДНК и трансгенов поделиться идентичны cohesiве свесы наводит на мысль, образования сложных экстра-хромосомной массивы клеток хозяина может признать для правильной передачи ДНК (gDNA подготовлен с использованием Сигма G1N10 комплект).
4. ДНК пищеварения
   Ограничение ферменты используются для линеаризации PPA-EGL-4p:: GFP векторной ДНК и производить липкой свесы совместимый с со-инъекции маркер pRL3 и PS312 gDNA. Смешать, нажав, не вортексе. Выдержите в течение одного часа при температуре 37 ° C.

pRL3	4 мкг
10xbuffer	10 мкл
PstI (10 ед / мкл)	4 мкл
дН 2 O	~
Всего:	100 мкл
PPA-EGL-4p:: GFP	4 мкг
10-кратный буфер	10 мкл
SalI (10 ед / мкл)	4 мкл
дН 2 O	~
Всего:	100 мкл
gDNA PS312	10 мкг
10-кратный буфер	10 мкл
Pst я и я Сал (10 ед / мкл)	8 мкл
дН 2 O	~
Всего:	100 мкл

Таблица 1. Смесь для рестрикции Digest.

5. ДНК осадков и подготовка
   1. Добавить 1:10 ацетата натрия (3 M NaCOOCH ₃ рН 5,2) и в 2,5 раза объема 100% этанола, чтобы переварить продукт, добавить 20 нг / мкл гликогена, чтобы увидеть гранулы легче.
   2. Центрифуга при 14000 оборотов в минуту в течение 15 минут при 4 ° C.
   3. Декантируйте супернатант Типпинг медленно центрифужную пробирку с ног на голову и затем коснувшись ее на папиросной бумаги, убедившись, что шарик в безопасности в нижний угол трубку и свободного этанола.
   4. Добавьте 1 мл 75% этанола.
   5. Сразу спина при 14000 оборотов в минуту в течение 5 минут при температуре 4 ° C.
   6. Декантируйте супернатант медленно опрокидывания центрифужную пробирку с ног на голову, а затем нажав его на папиросной бумаги убедившись, что шарик его безопасным в нижний угол трубку и свободного этанола.
   7. Сухие гранулы в вакуумной центрифуге при 14000 оборотов в минуту в течение 5 минут на 25-30 ° С, до полного высыхания и полностью свободным от этанола.
   8. Добавить 30 мкл ТЕ или стерильной дН ₂ O и оставить на ночь при 4 ° С до смешивания кратко вихря.
   9. Таблица 2 описывает, как создать инъекция смеси из каждой очищенной ДНК для инъекций.
   10. Хранить при -20 ° C. После оттаивания смеси для инъекций, спина вниз по трубе в 14 000 оборотов в минуту в течение 5 минут, чтобы избавить частиц космического мусора, которые могутзасорить инъекционной иглой.

Генетический материал	Концентрация
PPA-EGL-4p:: GFP (SalI)	> 5 нг / мкл (0.1-10ng/μl)
pRL3 (PstI)	> 1 нг / мкл
gDNA PS312 (PstI + SalI)	> 60 нг / мкл
дН 2 O	~
Всего:	30 мкл

Таблица 2. PPA-ПРЛ-1 инъекция смеси

2. РНК-интерференция: В пробирке двойной синтез РНК

1. Использование ПЦР для амплификации гена. RHL091 5'-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 '(BamHI сайт) и RHL092 5'-tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3' (PstI сайта) были использованы для усиления 464 б.п. геномных фрагментовМента (положение 3-466) от pRL3 вектор, содержащий PPA-ПРЛ-1 (tu92) аллеля.
2. Дайджест ПЦР продукт с BamHI и PstI.
3. Лигировать фрагмент BamHI / PstI переваривается pL4440 RNAi кормления вектор ^2.
4. Преобразование вставлен вектор в компетентные клетки и выращивать их на Ампициллин LB пластины СМИ (50 мкг / мл).
5. Выберите успешно вставлен вектор методом ПЦР с использованием T7 праймеров.
6. Используйте T7 окружении ПЦР продукт, содержащий ПРЛ-1 гена, чтобы сделать двухцепочечной РНК дсРНК) с использованием БЛОК-IT RNAi синтеза комплект (Invitrogen).
7. Концентрация дсРНК Лучше всего, если> 200 нг / мл, до 1 мкг / мкл для инъекций.
8. Хранить при -20 ° C. После оттаивания смеси для инъекций, спин вниз по трубе в 14 000 оборотов в минуту в течение 5 минут, чтобы избавиться от частиц космического мусора, которые могут засорить инъекционной иглой.

3. Микроинъекция: Протокол для инъекций трансгенов и / или дсРНК

1. Инъекция иглы
   1. Установить Narishige иглы съемник (модель #: PC-10) температура:
      1. Поверните нижнюю ручку "Нагреватель № 2".
      2. Включите "№ 2 Нагреватель Adj". ручку, пока панель читается 55.0-60.0 ° С в течение конические кончика иглы разной длины.
   2. Поверните нижнюю ручку обратно в "Шаг 1" (Тянет иголку в один шаг).
   3. Нагрузка иглы в камеру и убедитесь, что это безопасно.
   4. Нажмите кнопку "Пуск" (красная трубка) и позволяют иглы вырваться со всеми весами (это должно сделать две одинаковые иглы в противоположных направлениях).
   5. Удалите иглу из камеры и храните в пластиковой пластиной культуры закреплен на Play-Doh для предотвращения пыли на иглы.
2. Монтажные колодки
   1. В 1,5 мл трубки центрифуги, делают 2% Благородный решение агар, добавив 0,02 г благородных Агар к 1 мл H ₂ O. Агар можно хранить при температуре 4 ° С до года.
   2. Тщательно перемешать ирасплавить агар в тепло блок установлен в> 88 ° C.
   3. Использование 1 мл микропипетки, поместите каплю жидкости 2% Благородный Агар к середине стекло (Фишер, 12-544-F).
   4. Свести, поставив другую стекло в верхней части капли.
   5. Повторите "Капля Шаг", пока не будет слой пяти-стекло.
   6. Удалите каждую стекло, сдвинув стекол друг от друга.
   7. Сухой сгладить агар накладка на предметных стеклах в вакуумной печи при температуре 70 ° С в течение 4 часов в течение ночи (или при комнатной температуре в течение ночи).
   8. Сделайте несколько колодки инъекций и хранить для будущего использования.
3. Микроинъекция в гермафродитами гонад

Рисунок 1. Схематическое изображение P. расШсиз анатомии. ясно ядерных клеток составляют женщины половых клеток (яйцеклеток) и серым цветом часть кишечника. Только один дистальных передней гонад показаноно обратите внимание на два дистальных гонад пересекаются друг с другом спинной около середины тела.

Рисунок 2. Изображения микроинъекции. () Конец инъекционной иглы находится в фокусе с крайней правой линии вытащил капиллярной части. По слегка касаясь кончиком иглы, что край, иглы должны ломаться с сохранением острие. (В) игла вставляется в верхнюю гонад чуть выше кишечнике кривизны для первой инъекции. (C) игла вставляется в нижнюю гонад чуть ниже кишки кривизны для второй инъекции.

3. 1. Убедитесь, что контраст и DIC настройки стрижки идеально подходит для просмотра гермафродит половых желез.
   2. Нагрузка 1,0-2,0 мкл инъекции смеси в капиллярной вытащил иглу.
   3. Место иголку в микроинъекции манипулятором; манометры азота бак должен быть установлен в идеальных условиях (10-20 фунтов на квадратный дюймза 0,5-1 сек).
   4. Перерыв иглы, коснувшись его слегка краю тонко потянул капилляр помещают на предметное стекло (рис. 2A).
      1. Иглы выключателя слайд: тонкие части вытащил капиллярной размещены на предметное стекло в каплю масла
   5. Как только игла нарушается оно может быть места в положение холостого хода в то время как вы выбрали вашу червя площадку (П. расШсиз есть 5 минут, окно для инъекций, прежде чем они сухие, и умирают).
   6. Использование пластин полный Д4-червей молодых взрослых, влить достаточно нефти парафина (тяжелые), чтобы только покрыть все черви в OP50 бактериального газона.
   7. Выберите червя и разместить его на инъекции площадку.
   8. Место стекло с червя на микроскоп, положение гонад червя в направлении иглы и вульвы от иглы (рис. 2В, 2С).
   9. Опустите иглу в позиционировать микроскопа зрения.
   10. Установите верхний гонад и иглы в той же фокальной плоскости (рис. 2В).
   11. Ткните червь мягко и насос в инъекции смеси; ooctyes разделения на дистальный конец указывают успешных инъекций (Для оптимизации трансгена или дсРНК доставки, вы должны увидеть при инъекции волна расширения в половых желез, которая продолжается, пока он находится недалеко от дистального совет).
   12. Перемещение иглы для введения в нижнюю гонад и повторить инъекции, однако так как это гонад находится под кишечнике распространение ооцитов не будет видно и, следовательно, более трудно достичь (рис. 2С).
   13. Нормально ищет червя указывает на успешное инъекции после инъекции, там не должно быть никаких повреждений половых желез (выступает из вульвы или выскочил внутри полости тела).
   14. Место иглу в положение холостого хода.
   15. Приготовьтесь к спасению червя.
   16. Добавить каплю (0,5 мкл) буфера M9 на площадку, где вводится червь помещается.
   17. Используя некоторые OP50 бактерий на ваш выбор, сенсорный червя с OP50, и он должен придерживаться. WE не используют рот пипеткой.
   18. Место червя на пластине засеяно 50 мкл пятна OP50, 2-4 черви могут быть спасены на таких пластин.
4. После инъекции хранения и скрининг на трансгенез
   1. Магазин вводят черви (P ₀₎ при 20 ° С в течение ~ 4 дня, чтобы отложить яйца и вырастить F _1.
   2. Экран червей на четвертый день для выбранных фенотип (На экран для трансгенез, поиск подвижного животных выразив PPA-ПРЛ-1 доминирующим маркер).
   3. Выберите одного независимого F ₁ 'с с животными наблюдали фенотипа к новым посеяны пластины и храните при температуре 25 ° C; эта температура способствует образованию устойчивых линий от F _1' s.
   4. Одноместный F ₂ от независимых F ₁ линий. Индивидуальные F _{2 строки} имеют схожие скорости передачи трансгена. Мы часто получаем> 15 F ₂ строк на преобразован F ₁ животное.
   5. Магазин последующих поколений при 25 ° C.
   6. Скорость передачи роликов обычно остается постоянной после F ₄ поколения, при этом необходимо в это время, чтобы определить уровень экспрессии целевого трансгена (PPA-EGL-4p:: GFP) для каждой отдельной строке. GFP выражения не коррелируют со степенью пенетрантность доминирующим фенотип ролика.
5. После инъекции хранения и скрининг на фенотипы RNAi
   1. Магазин вводят черви (P ₀₎ при 20 ° С в течение ~ 4 дня, чтобы заложить и вырастить F _1.
   2. Экран F ₁ червей на четвертый день для выбранных фенотип (для выявления РНК-интерференции нокдаун фенотип, поиск для капиллярного фенотипов, которые могут быть связаны с потерей целевой активности генов, в нашем случае потери PPA-ПРЛ-1 фенотип).
   3. По нашему опыту, не-ролик нокдаун фенотип теряется в> 97% от F _2.

4. Представитель результаты:

р "> 1. Результат трансгенеза

Сессия	Injected P 0	F 1 Ролики	% Трансгенных F 2	Средний% после передачи F 2
1	60	2	(Линия 1) 0% (Линия 2) 13%	Не Доступно 13% ± 10
2	40	1 *	(Линия 3) 0%	Не Доступно
3	40	0	0%	Не Доступно
4	40	1	(Линия 4) 0%	Не Доступно
5	20	0	0%	Не Доступно
6	40	1	(Линия 5) 26%	22% ± 10

Содержание "> * мужской ролик, который не крест, Н. А.: Не применимо

. Таблица 3 Результаты вводят PS312 с PPA-EGL-4p:: GFP (Сал я перевариваются), pRL3 (ролик) (Pst я переваривается) и gDNA PS312 (PstI и SalI переваривается).

Рисунке 3 () дикого типа (В, С) стабильная F ₄ pRL3; PPA-EGL-4р.:: GFP трансгенные линия, показывающая голову нейрона GFP выражения.

2. Результат РНК-интерференции

Рисунок 4. РНК вводили ПРЛ-1 мутантов показать полный нокдаун "скользящий" передвижения. () ПРЛ-1 ролик получить-функции мутанта tu92. (B) "сбил" ПРЛ-1 мутант выставку нормальной позе дикого типа и передвижения. (C) Injected ПРЛ-1 (нижняя) также имеет больше боды, чем ПРЛ-1 мутант (сверху). (D) больше тела вводят ПРЛ-1 (нижняя) также больше, чем дикого типа PS312 (сверху). Больше тела фенотип наблюдался также в РОЛ-5 (SQT-1) RNAi нокдаун C. Элеганс N2 (данные не представлены).

	рулон	не-ролл
ПРЛ-1 дсРНК (200 нг / мкл)	13	21
В ПРЛ-1 дсРНК (1000 нг / мкл)	9	16
контроль	20	2

Таблица 4. Резюме PPA-ПРЛ-1 дсРНК инъекций. () [ДсРНК] = 200 нг / мкл; (B) [дсРНК] = 1000 нг / мкл. Р = 0,0019 и 0,041 на точный критерий Фишера, двусторонний, на 200 и 1000 нг / мкл инъекции, соответственно.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

П. расШсиз населения находятся в тесной связи с различными скарабей видов по всему миру и представляет собой модель нематоды промежуточным между свободными и паразитических нематод. Сила П. расШсиз в качестве новой модели организма заключается в интеграции ее генетические и...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Продукт:	Каталог #:	Поставщик:
DMI3000 инъекций микроскопом	DMI3000	Leica
Microinjector манипулятор (прямой привод)	Narashige ВС-3 Шарнир	Tritech исследований
Иглы Puller	Narashige PC-10	Tritech исследований
MicroInjector ™ Все-Digital Multi-давление в системе	Narashige MINJ-D	Tritech исследований
GeneElute ™ млекопитающих Геномная ДНК Miniprep Kit	G1N70	Сигма
pJet Клонирование Jet комплект	K1231	Fermentas
GeneJET плазмиды Miniprep комплект	K0502	Fermentas
Чистая ДНК и концентратор ™	D4005	ZYMO исследований
БЛОК-IT ™ RNAi ТОПО ® транскрипции комплект	K3500-01-K3650-01	Invitrogen
Difco ™ Агар Благородный	DF0142-15-2	Фишер Scientifi
Микроскоп покровного стекла (1,5 - 0,16 до 0.19mm толстый; Размер: 50 х 45 мм)	12-554-F	Fisher Scientific
Стекло капилляров (нить)	615000	AM системы
Парафин нефти (жесткие)	O122-1	Fisher Scientific
KH 2 PO 4	P386-500	Fisher Scientific
Na 2 HPO 4	AC20651-5000	Fisher Scientific
NaCl	BP3581	Fisher Scientific
MgSO 4	M80-500	Fisher Scientific