RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus</em

Özet

RNAi spesifik mRNA transkript 1-2 demonte model organizmalar, transgenesis gen işlevleri işleyebilirsiniz. Bu protokol, necromenic nematod içine stably iletilen DNA ve geçici çift iplikli RNA tanıtmak için gerekli teknikleri göstermek için hedefliyor Pristionchus pacificus, Evrimsel gelişim ve davranış biyolojisi çalışmaları için.

Özet

RNA girişim ve istikrarlı transgenesis gen fonksiyonu ve ifade analizleri derinlemesine daha fazla, tamamen sıralı genomların elde birçok türün özellikle anatomi ve organizmanın moleküler hücre biyolojisi nedeniyle sınırlı kalmaktadır. Gelişmekte olan model organizmalar için gittikçe daha uygun fiyatlı olmasına rağmen Örneğin, stably Caenorhabditis olmayan türlerin transgenik hatları bulaşan Caenorhabditis elegans ^3, taç grup Caenorhabditis dışında Strongyloides stercoralis ⁴ ve Pristionchus pacificus ⁵ istisna ile, bu aldatıcı filumun (Nematoda) bildirilmiştir değil. P. genişleyen rolünü kolaylaştırmak için çalışmada, gelişme, evrim, ve ^davranış 6-7 pacificus, biz burada, transgenik hayvanlar ve gen RNAi tarafından yıkmak yapmak için mikroenjeksiyon kullanmak için geçerli yöntemleri açıklanmaktadır. Gonadlar gibi P. gonadlar pacificus syncitial ve doğrudan mikroenjeksiyon tarafından teslim oosit içine DNA ve RNA içeren yeteneğine sahip. C. aksine P. de elegans Ancak, istikrarlı transgen miras ve somatik ifade pacificus hedef transgenlerin ve coinjection belirteçler ⁵ biter tamamlayıcı endonükleaz ile sindirilir kendini genomik DNA eklenmesini gerektirir. Ayrıca taşıyıcı genomik DNA Strongyloides stercoralis ⁴ ve C germ hücreleri transgen ifade gereksinimi için benzer elegans. Ancak, bu hayvanların kendi genomik DNA için spesifik bir gereklilik ise açık değildir, çünkü P. pacificus soma karmaşık olmayan çok kopyalı genlerin susturulması ya da çok verimli P. içinde ekstrakromozomal diziler pacificus mitoz sırasında uygun kinetochore montaj için genomik dizileri gerektirir. Iki kollu (ventral göççift ​​cinsiyetli olarak didelphic) gonadlar, bireysel ^solucanlar 8 hem de gonadlar enjekte yeteneği daha da zorlaştırmaktadır. Ayrıca demonte haddeleme olmayan F ₁ döl elde etmek için çift iplikli RNA (dsRNA) gonadlar içine enjekte edilerek baskın bir mutant (rulo, tu92) mikroenjeksiyon kullanımı göstermektedir. C. aksine elegans, ancak diğer pek çok nematod gibi, P. pacificus PS312 besleme ve iliklerine ve bu nedenle dsRNA syncitial gonadlar içine mikroenjeksiyon tarafından uygulanmalıdır yoluyla sistemik RNAi açık değildir. Bu çalışmada, biz Ppa-egl-4 organizatörü dönüştürmek için gerekli olan mikroenjeksiyon işlemi tanımlamak için umut: GFP füzyon muhabir ve demonte baskın bir rulo PRL-1 (tu92) mutant görsel bilgilendirici bir protokoldür.

Protokol

1. Transgenesis: DNA hazırlığı

1. Hakim ko-enjeksiyon belirleyicisi: pRL3 [Ppa-PRL-1 (tu92)]
   PRL3 plazmid görsel olarak başarılı bir dönüşüm olayları tanımlamak için, baskın bir ko-enjeksiyon belirteç . Bu plazmid yakından C. SQT-1 kolajen geni ile ilgili Ppa-PRL-1 geni baskın bir mutant allel (tu92) için kodlar elegans ve wild tip sinüzoidal lokomosyon solucan vücut ekseni ^1,5 boyunca saat yönünde büküm hareketleri haline dönüştürür. Dönüştürülmüş hayvan C. kullanılan popüler bir baskın seçim işaretleyici rol-6 (su1006) çok benzer. Geçtiğimiz 20 yıl boyunca elegans.
2. Hedef muhabiri transgen: Ppa-egl-4p: GFP
   Ilgi bir gen dizisi ⁹ kodlama GFP transkripsiyonel veya translationally bağlantılı olabilir. Bu çalışmada, Ppa-egl-4promoter: GFP (egl-4, cGMP bağımlı protein kinaz) kullanımıçeviri başlangıç ​​upstream 2 kb parçası S. GFP ifade kazandırmaz eğer d belirlemek için pacificus PS312. Bu GFP vektör modifiye ile GFP kodlama bölgeyi içeren
   intron ve çok amaçlı Ppa-rpl-23 nazik Xiaoyue Wang ve Ralf J. Sommer (Max-Planck Enstitüsü, Tübingen, Almanya, AB) tarafından sağlanan 3 'UTR terminatör ^5.
3. Genomik DNA: PS312
   Ayrıca yabani-tip P. pacificus PS312 genomik DNA, özellikle transgenik _F 1, _F 2 ^döl 5 hayvanlar, istikrarlı transgen miras almak için gereklidir . Kararlı F ₂ transgenik hatları görülenlere benzer: genomik DNA iki transgenlerin (GFP muhabiri: ko-enjeksiyon işaretleyici PRL-3 ve Ppa-egl-4p) ile karmaşık ekstra kromozom dizileri oluşturur henüz belli değil C. elegans ^3. Ancak, aynı cohesi gereksinimi paylaşmak için genomik DNA ve transgenlerin varve çıkıntılar, güçlü konak hücrelerine doğru DNA şanzıman (gDNA Sigma G1N10 kiti kullanılarak hazırlanmıştır) tanıyabilir karmaşık ekstra-kromozomal dizileri oluşumunu göstermektedir.
4. DNA sindirimi
   : GFP vektör DNA ve ko-enjeksiyon işaretleyici pRL3 ve PS312 gDNA uyumlu yapışkan çıkıntılar üretmek için: Kısıtlama enzimler Ppa-egl-4p linearize için kullanılır. Vorteks değil, dokunarak karıştırın. 37 az bir saat boyunca inkübe ° C

pRL3	4 mikrogram
10xbuffer	10 ul
PstI (10 U / ml)	4 ul
dH 2 O	~
Toplam:	100 mcL
Ppa-egl-4p: GFP	4 mikrogram
10x tampon	10 ul
Sali (10 U / ml)	4 ul
dH 2 O	~
Toplam:	100 ul
gDNA PS312	10 mikrogram
10x tampon	10 ul
PstI'in ve Sal I (10 U / ml)	Ul 8
dH 2 O	~
Toplam:	100 ul

Tablo 1 Kısıtlama Enzim Digest için karışım.

5. DNA yağış ve hazırlık
   1. 1:10 sodyum asetat (3 M _NaCOOCH-3 pH 5.2) ve sindirilmiş ürün% 100 etanol hacmi 2.5X ekle, pelet daha kolay görmek için 20 ng / glikojen ul ekleyin .
   2. 15 dakika 14.000 rpm'de Santrifüj 4 ° C
   3. Tippi tarafından süpernatant Durusuyavaş yavaş ng santrifüj tüpü baş aşağı ve daha sonra bir kağıt mendil, dokunarak, pelet, tüpün alt köşesindeki güvenli olduğundan emin ve etanol ücretsiz.
   4. 1 ml% 75 etanol ekleyin.
   5. Hemen 4 5 dakika 14.000 rpm az dönmeye ° C
   6. Yavaş ters santrifüj tüpüne devrilme ve sonra bir kağıt mendil pelet bu tüpün alt köşesindeki güvenli ve emin etanol dokunarak süpernatant Durusu.
   7. Kuru pelet 5 dakika 14.000 rpm'de santrifüj vakum 25-30 ° C, kuru ve tamamen ücretsiz etanol kadar.
   8. TE veya steril dH ₂ O 30 ul ekleyin ve bir girdap ile 4 ° C karıştırma kısa bir süre önce bir gece bekletin.
   9. Tablo 2, enjeksiyon karışımı enjeksiyon için her saflaştırılmış DNA nasıl oluşturulacağı anlatılmaktadır.
   10. -20 ° C'de muhafaza Enjeksiyon karışımı çözündükten sonra olabilir enkaz parçacıklar kurtulmak için tüp 5 dakika 14.000 rpm'de aşağı doğru döndürünenjeksiyon iğnesi tıkayabilir.

Genetik materyal	Konsantrasyon
Ppa-egl-4p: GFP (Sali)	> 5 ng / ul (0.1-10ng/μl)
pRL3 (PstI)	> 1 ng / ml
gDNA PS312 (PstI + Sali)	> 60 ng / ml
dH 2 O	~
Toplam:	30 ul

(Tablo 2). Ppa-PRL-1 enjeksiyon karışımı

2. RNA Girişim: in vitro çift zincirli RNA sentezi

1. PCR ilgi gen yükseltmek için kullanın. RHL091 5'-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC 3 '(BamHI site) ve RHL092 5'-tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3' (PstI site) 464 bp genomik frag yükseltmek için kullanılır.Ppa-PRL-1 (tu92) aleli içeren pRL3 vektör Ment (konum 3-466).
2. BamHI ve PstI ile PCR ürünü Digest.
3. BamHI / PstI pL4440 RNAi besleme vektör ² sindirilir parçası Arter.
4. Yetkili hücrelerin içine eklenen vektör Dönüşümü ve Ampisilin LB medya levhalar (50 mg / ml) onları büyümek.
5. T7 primerler kullanılarak PCR ile başarıyla takılı vektör seçin.
6. BLOK-IT RNAi sentezi kiti (Invitrogen) kullanarak) çift iplikli RNA dsRNA yapmak için PRL-1 geni içeren PCR ürünü çevrili T7 kullanın.
7. Kadar 1 enjeksiyon için mikrogram / ul> 200 ng / ml, dsRNA konsantrasyonu en iyi.
8. -20 ° C'de muhafaza Enjeksiyon karışımı çözündükten sonra, bir iğne tıkayabilir enkaz parçacıkların kurtulmak için tüp 5 dakika 14.000 rpm'de dönerler.

3. Mikroenjeksiyon: transgenlerin ve / veya dsRNA enjeksiyon Protokolü

1. Enjeksiyon İğnesi
   1. Sıcaklığı: Narishige iğne çektirmesi (PC-10 model #) ayarlayın
      1. Alt düğmeyi çevirin "No.2 Isıtıcı."
      2. "No.2 Isıtıcı Ayarı" Turn. paneli kadar okur topuzu 55,0-60,0 ° C değişen uzunluklarda konik iğne ucu.
   2. (Bir adım iğne çeker) "Adım 1" geri altındaki düğmeyi çevirin.
   3. Iğne odasına yükleyin ve güvenli olduğundan emin olun.
   4. "Başlat" düğmesini (kırmızı düğme) basın ve iğne (bu iki zıt yönlerde aynı iğne yapmak gerekir) tüm ağırlıkları ile çekilmesine izin verir.
   5. Iğne, iğneler üzerinde biriken tozu önlemek için Play-Doh ile sabitleniyor plastik bir kültür plaka oda ve mağaza çıkarın.
2. Montaj Pedleri
   1. 1,5 ml santrifüj tüpüne, 1 ml H ₂ O Noble Agar 0,02 g ekleyerek% 2 Noble Agar çözüm Agar, 4 ° C ile bir yıl kadar saklanabilir.
   2. İyice karıştırın ve> 88 ° C'ye ayarlanmış bir ısı bloğu agar eritebilir
   3. 1 ml mikropipet kullanarak, (Fisher, 12-544-F) sıvı% 2 Noble Agar bir damla cam slayt ortasına yerleştirin.
   4. Damla üstünde başka bir cam slayt koyarak düzleştirin.
   5. "Bırak Adım" Beş cam slayt bir katman kalmayıncaya kadar tekrarlayın.
   6. Her cam sürgülü cam slayt çıkarın birbirlerine slaytlar.
   7. Kuru bir elektrikli fırında 70 cam slaytlar agar ped düzleştirmek ° C gecede 4 saat (ya da oda sıcaklığında gece).
   8. Ileride kullanmak için birden fazla Enjeksiyon pedleri ve mağaza olun.
3. Hermaphroditic gonadlar içine mikroenjeksiyon

Şekil 1. P. şematik çizim pacificus anatomi net çekirdekli hücreler dişi germ hücreleri (oosit) ve gri gölgeli kısmı bağırsak. Sadece bir distal anterior gonad gösterilirama iki distal gonadlar, gövde ortasında yakın dorsal birbirlerine çapraz dikkat edin.

Şekil 2. Görüntüleri mikroenjeksiyon, (A) enjeksiyon iğne ucu çekti kılcal parçasının aşırı sağ bir çizgi ile odak . Keskin bir nokta hala korurken, bu kenarı iğne ucu hafifçe dokunarak, iğne ucu ayrılmalıyız. (B) üst içine iğne ekler sadece ilk enjeksiyon için bağırsak eğriliği yukarıdaki gonaden. (C) altına iğne ekler ikinci enjeksiyon için sadece gut eğrilik altında gonaden.

3. 1. Kontrast ve DIC kesme ayarı hermafrodit gonadlar görüntülemek için ideal olduğundan emin olun.
   2. Çekti kılcal iğne içine enjeksiyon karışımı 1.0-2.0 ul yükleyin.
   3. Mikroenjeksiyon manipülatör iğne yerleştirin; nitrojen tankı basınç göstergeleri ideal koşulları belirlenmiş olmalıdır (10-20 psi0.5-1 saniye süreyle).
   4. Iğne ucu bir slayt (Şekil 2A) yerleştirilen, ince çekti kılcal tüp kenarına hafifçe dokunarak kırın.
      1. İğne kesici slayt çekti petrol bir damla cam bir slayt üzerine yerleştirilen kapiller ince parçası
   5. İğne sonra (P. pacificus onlar kuru önce enjeksiyon için 5 dakikalık bir pencere var ve ölmek) pad solucan almak ise atıl bir konumda yer olabilir.
   6. J4-genç erişkin solucanlar dolu bir tabak kullanarak, tüm solucanlar OP50 bakteriyel çim kapağı sadece yeterli parafin yağı (ağır) dökün.
   7. Pick bir solucan ve enjeksiyon pad üzerine yerleştirin.
   8. Iğne ve iğne (Şekil 2B, 2C) uzak vulva yönde pozisyon solucan gonad mikroskop solucan ile cam slayt yerleştirin.
   9. Mikroskop görünümü konumu iğne indirin.
   10. Aynı odak düzlemi (Şekil 2B) üst gonad ve iğne yerleştirin.
   11. Yavaşça solucan Poke ve pompa enjeksiyon karışımı; distal uç doğru ayıran ooctyes (transgen veya dsRNA teslim optimize etmek için başarılı bir enjeksiyon gösterir, enjeksiyon üzerine distal yakın olana kadar devam gonad genişleme dalgası görmelisiniz ucu).
   12. Yeniden konumlandırmak alt gonad ve tekrar enjeksiyon enjekte etmek için iğne, bu gonad oositlerin yayılması olmayacaktır bağırsak altında ve (Şekil 2C) ulaşmak için böylece daha zor ancak.
   13. Normal görünümlü solucan enjeksiyondan sonra başarılı bir enjeksiyon gösterir; (vulva dışarı çıkıntılı ya da vücut boşluğunun içine attı) herhangi bir hasarlı gonadlar olmamalıdır.
   14. Rölanti iğne geri yerleştirin.
   15. Solucan kurtarmak için hazırlayın.
   16. M9 tampon enjekte solucan yerleştirilen ped üzerine bir damla (0.5 ul) ekleyin.
   17. OP50 bakteri tercihinizi kullanarak, solucan OP50 ile dokunma, ve sopa olmalıdır. We, ağız pipeti kullanmayın.
   18. Solucan tabağa OP50 50 ul noktalar ile seeded yerleştirin, 2-4 solucanlar gibi plakalar kurtarıldı olabilir.
4. Transgenesis için enjeksiyon sonrası Depolama ve Tarama
   1. Mağaza 20 (P ₀₎ solucanlar enjekte ° C ~ 4 gün yumurtalarını ve F ₁ büyüyecek.
   2. Seçili fenotip (transgenesis Ppa-PRL-1 hakim işaretleyici ifade yuvarlanan hayvanlar için, arama ekran) için dördüncü gününde Ekran solucanlar.
   3. Tek bağımsız F ₁ Pick 25 yeni numaralı seribaşı plaka ve saklamak için gözlenen bir fenotip ile hayvanlar ° C; bu sıcaklık _F 1 istikrarlı çizgilerin oluşumunu teşvik eder ' s.
   4. Tek F ₂ F ₁ hatlarından bağımsız. Bireysel F ₂ satır benzer transgen aktarım hızlarına sahip. Biz genellikle> 15 elde F dönüştürülmüş F ₁ hayvan başına ₂ satır.
   5. 25 ° C'de sonraki nesillere Mağaza
   6. Her bir hat için: silindirleri iletim hızı genellikle bu hedef transgen ekspresyon seviyesi (GFP: Ppa-egl-4p) belirlemek için şu anda gerekli olan F ₄ nesil sonra sabit kalır. GFP ifade baskın rulo fenotip penetrans derecesi ile ilişkili olmayabilir.
5. RNAi fenotipleri için enjeksiyon sonrası Depolama ve Tarama
   1. Mağaza 20 (P ₀₎ solucanlar enjekte ° C ~ 4 gün yattı ve F ₁ büyümek için.
   2. Ekran F seçilen fenotip (RNAi demonte fenotipi Ppa-PRL-1 fenotip kaybı bizim durumumuzda, hedef gen aktivitesinin kaybı ile ilişkili olabilir penetrant fenotipleri için arama için ekran) dördüncü gününde ₁ solucanlar.
   3. Deneyimlerimize göre, non-silindiri demonte fenotip F _2>% 97 kaybolur.

4. Temsilcisi sonuçları:

Transgenesis p "> 1 Sonuç

Oturum	P 0 Injected	F 1 Silindirler	% Transgenik F 2	Ortalama% iletim F 2 sonra
1	60	2	(Hat 1) 0% (2 hat)% 13	NA % 13 ± 10
2	40	1 *	(3 hat)% 0	NA
3	40	0	% 0	NA
4	40	1	(4 hat)% 0	NA
5	20	0	% 0	NA
6	40	1	% 26 (5 hat)	% 22 ± 10

içeriği "> çapraz vermedi * makaralı bir erkek; NA: Uygulanabilir değil

: GFP (Sal I sindirilir), pRL3 (rulo) (PstI'in sindirilir) ve gDNA PS312 (PstI ve Sali sindirilir): Tablo 3 Sonuçları Ppa-egl-4p enjekte PS312.

Şekil 3. (A) wild tip (B, C) ​​istikrarlı bir F ₄ pRL3; Ppa-egl-4p:: nöron GFP ifade baş gösteren GFP transgenik hattı.

2. RNA girişim sonucu

Şekil 4. RNA PRL-1 mutantlar "yuvarlanan" hareketin komple demonte (A) PRL-1 rulo kazanç fonksiyon-mutant tu92 enjekte etti. (B) PRL-1 mutant sergi, normal wild tip duruş ve hareket "nakavt". (C) PRL-1 (alt) da uzun b Injecteddaha ody PRL-1 mutant (üstte). (D) uzun vücut enjekte PRL-1 (alt) (üst) wild tip PS312 daha uzun da. Uzun vücut fenotip aynı zamanda rol-5 C. (SQT-1) RNAi demonte gözlendi elegans N2 (veriler gösterilmemiştir).

	rulo	non-roll
Bir PRL-1 dsRNA (200 ng / ul)	13	21
Yatak PRL-1 dsRNA (ng / ul 1000)	9	16
kontrol	20	2

Tablo 4 Ppa-PRL-1 dsRNA enjeksiyonları özeti. (A) [dsRNA] = 200 ng / ul; (B) [dsRNA] = 1000 ng / ul. P = 0.0019 ve 0.041, sırasıyla 200 ve 1000 ng / ul enjeksiyonları için iki kuyruklu Fisher Exact Testi,,.

Tartışmalar

P. pacificus popülasyonları dünya çapında çeşitli bokböceği böcek türleri ile yakın ilişkisi bulunan ve serbest yaşayan ve paraziter nematod arasındaki ara bir model nematod . P. gücü gelişmekte olan bir model organizma olarak pacificus tarafsız ileri genetik ekranlarını izole mutantlar teşvik pozisyonel haritalama, genetik ve fiziksel haritalar entegrasyonu yatıyordu (yani sadece daha önce C. elegans karakterize aday genler için) ^6,10. Anc...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ürün:	Katalog #:	Faaliyet alanı:
DMI3000 Enjeksiyon mikroskop	DMI3000	Leica
Mikroenjektör manipülatör (Direct drive)	Narashige BC-3 Rotil	TriTech Araştırma
İğne Çektirme	Narashige PC-10	TriTech Araştırma
Mikroenjektör ™ All-Dijital Multi-basınç sistemi	Narashige MINJ-D	TriTech Araştırma
GeneElute ™ Memeli Genomik DNA Miniprep Seti	G1N70	Sigma
pJet Klonlama Jet kiti	K1231	Fermentas
GeneJET plazmid Miniprep kiti	K0502	Fermentas
DNA Clean & Konsantratörü ™	D4005	ZYMO Araştırma
BLOK-IT ™ RNAi TOPO ® transkripsiyon kiti	K3500-01 ve K3650-01	Invitrogen
Difco ™ Agar Noble	DF0142-15-2	Fisher bilimsel
Mikroskop cam kapak (1.5 - 0,16 - 0,19 mm kalınlığında; Boyut: 50 x 45mm)	12-554-F	Fisher Scientific
Cam kılcal damarlar (filament)	615000	AM sistemleri
Parafin Yağı (Ağır)	O122-1	Fisher Scientific
KH 2 PO 4	P386-500	Fisher Scientific
Na 2 HPO 4	AC20651-5000	Fisher Scientific
NaCl	BP3581	Fisher Scientific
MgSO 4	M80-500	Fisher Scientific