RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Zusammenfassung

In Modell-Organismen, kann Transgenese manipulieren Genfunktionen während RNAi kann Knockdown spezifische mRNA-Transkripte 1-2. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Techniken benötigt, um stabil zu übertragen DNA und vorübergehend doppelsträngige RNA in die necromenic Nematoden Einführung illustrieren Pristionchus pacificus Für ein Studium in der Evolution, Entwicklungs-und Verhaltensbiologie.

Zusammenfassung

Zwar ist es immer günstiger für neue Modell-Organismen vollständig sequenzierten Genomen zu erhalten, weitere eingehende Genfunktion und Expressionsanalysen durch RNA-Interferenz und stabile Transgenese beschränkt bleiben in vielen Arten aufgrund der besonderen Anatomie und molekulare Zellbiologie des Organismus. Zum Beispiel haben außerhalb der Krone Gruppe Caenorhabditis dass Caenorhabditis elegans ^3, stabil übertragen transgenen Linien in nicht-Caenorhabditis Arten gehören nicht in dieses scheinbare Stamm (Nematoda) berichtet worden, mit Ausnahme der Zwergfadenwurm ⁴ und Pristionchus pacificus ^5. Zur Erleichterung der wachsenden Rolle von P. pacificus in das Studium der Entwicklung, Evolution und Verhalten ^6-7, beschreiben wir hier die aktuellen Methoden zur Mikroinjektion zur Herstellung transgener Tiere und Gen-knock down von RNAi nutzen. Wie die Keimdrüsen P. pacificus ist syncitial und in der Lage Einbeziehung DNA und RNA in die Oozyten, wenn sie durch direkte Mikroinjektion geliefert. Im Gegensatz zu C. elegans jedoch stabil transgene Erbschafts-und somatische Expression in P. pacificus erfordert die Zugabe von selbst genomischer DNA mit Restriktionsendonukleasen komplementär zu den Enden der Ziel-Transgenen und Koinjektions Marker ⁵ verdaut. Die Zugabe von Carrier genomische DNA ist vergleichbar mit der Forderung nach Transgenexpression in Zwergfadenwurm ⁴ und in den Keimzellen von C. elegans. Es ist jedoch nicht klar, ob die spezifischen Anforderungen für die Tiere eigene genomische DNA ist, weil P. pacificus soma ist sehr effizient zum Schweigen zu nicht-komplexe multi-copy-Gene oder extrachromosomale Arrays in P. pacificus benötigen genomischen Sequenzen für die ordnungsgemäße Montage Kinetochor während der Mitose. Die ventralen Migration des zweiarmigen (didelphic) Gonaden in Hermaphroditen erschwert die Fähigkeit, sowohl Gonaden in einzelnen Würmer ⁸ zu injizieren. Wir zeigen auch die Verwendung von Mikroinjektion den Zuschlag eine dominante Mutante (roller, tu92) durch die Injektion von doppelsträngiger RNA (dsRNA) in den Keimdrüsen zu Non-Rolling F ₁ Nachkommen zu erhalten. Im Gegensatz zu C. elegans, aber wie die meisten anderen Nematoden, P. pacificus PS312 ist nicht empfänglich für systemische RNAi über Fütterung und Tränkung und daher dsRNA müssen durch Mikroinjektion in die syncitial Gonaden angewendet werden. In dieser aktuellen Studie hoffen wir, die Mikroinjektion Prozess benötigt wird, um ein PPA-EGL-4 Promotor verwandeln beschreiben:: GFP-Reporter und Knockdown eine dominierende Rolle prl-1 (tu92)-Mutante in einer visuell informative Protokoll.

Protokoll

1. Transgenese: DNA-Präparation

1. Dominant Co-Injektion Marker: pRL3 [PPA-prl-1 (tu92)]
   Die pRL3 Plasmid ist ein dominantes Co-Injektion Marker für visuell identifiziert erfolgreiche Transformation Veranstaltungen. Dieses Plasmid kodiert für eine dominante mutierte Allel (tu92) des PPA-prl-1-Gen eng mit der SQT-1 Kollagen-Gens in C. im Zusammenhang elegans und verwandelt den Wildtyp sinusförmige Bewegung in Uhrzeigersinn drehen Bewegungen entlang der Wurm den Körper Achse ^1,5. Die transformierten Tier ist sehr ähnlich wie die beliebten dominanten Selektionsmarker rol-6 (su1006) in C eingesetzt elegans in den vergangenen 20 Jahren.
2. Ziel Reporter-Transgen: PPA-EGL-4P:: gfp
   Ein Gen von Interesse kann transkriptionell oder translatorisch zu einem GFP kodierende Sequenz ⁹ verbunden werden. In dieser Studie, die PPA-EGL-4promoter:: gfp (EGL-4, cGMP-abhängigen Proteinkinase) was verwendet werden, um festzustellen, ob ein 2 kb-Fragment vor dem Start der Übersetzung kann GFP-Expression in P. verleihen pacificus PS312. Dieses GFP-Vektor enthält eine GFP kodierende Region mit modifiziertem
   Introns und der Mehrzweck-PPA-rpl-23 3 'UTR Terminator ⁵ freundlicherweise von Xiaoyue Wang und Ralf J. Sommer (Max-Planck-Institut, Tübingen, Deutschland, EU) zur Verfügung gestellt.
3. Genomic DNA: PS312
   Die Zugabe von Wildtyp P. pacificus PS312 genomische DNA ist erforderlich, um stabile Transgenexpression Erbe zu erhalten, insbesondere von transgenen F ₁ Tiere, um ihre F ₂ Nachkommen ^5. Es ist noch nicht sicher, ob die genomische DNA bildet komplexe extrachromosomale Arrays mit den beiden Transgene (die Co-Injektion Marker PRL-3 und der PPA-EGL-4P:: gfp-Reporter), ähnlich denen in stabilen F ₂ transgenen Linien beobachtet C. elegans ^3. Um jedoch die Anforderung haben die genomische DNA und Transgene zu identica Aktienl Zusammenhalt Überhänge stark darauf hin, die Bildung von komplexen extra-chromosomale Arrays der Wirtszellen für die richtige DNA-Übertragung (gDNA hergestellt unter Verwendung von Sigma G1N10 Kit) erkennen kann.
4. DNA-Spaltung
   Restriktionsenzyme werden verwendet, um die PPA-EGL-4p linearisieren:: GFP-Vektor-DNA und klebrig Überhänge mit den Co-Injektion Marker pRL3 und PS312 gDNA zu produzieren. Mix durch Antippen, nicht vortexen. Inkubieren für eine Stunde bei 37 ° C.

pRL3	4 ug
10xbuffer	10 pl
PstI (10 U / ul)	4 ul
dH 2 O	~
Total:	100 ul
PPA-EGL-4P:: gfp	4 ug
10x Puffer	10 pl
SalI (10 U / ul)	4 ul
dH 2 O	~
Total:	100 ul
gDNA PS312	10 ug
10x Puffer	10 pl
Pst I und Sal I (10 U / ul)	8 ul
dH 2 O	~
Total:	100 ul

Tabelle 1. Mixture für Restriktionsenzymverdau.

5. DNA-Fällung und Vorbereitung
   1. Add 01.10 Natriumacetat (3 M NaCOOCH ₃ pH 5,2) und 2,5-fache des Volumens von 100% Ethanol zum verdaut Produkt, fügen Sie 20 ng / ul von Glykogen, um zu sehen Pellet leichter.
   2. Zentrifuge bei14.000 rpm für 15 Minuten bei 4 ° C.
   3. Den Überstand durch Kippen langsam dem Zentrifugenröhrchen auf den Kopf und dann darauf tippen auf ein Tissue-Papier, um sicherzustellen, dass die Pellets sicher ist in der unteren Ecke des Rohres und frei von Ethanol.
   4. 1 ml 75% Ethanol.
   5. Unmittelbar bei 14.000 rpm Spin 5 Minuten bei 4 ° C.
   6. Den Überstand durch langsames Kippen der Zentrifugenröhrchen auf den Kopf und dann darauf tippen auf ein Tissue-Papier darauf achten, dass das Pellet es in der unteren Ecke des Rohres sicher und frei von Ethanol.
   7. Dry Pellet im Vakuum Zentrifuge bei 14.000 rpm für 5 Minuten bei 25-30 ° C, bis es trocken und völlig frei von Ethanol.
   8. Add 30 ul TE oder sterilem dH ₂ O und lassen über Nacht bei 4 ° C vor dem Mischen kurz mit einem Vortex.
   9. Tabelle 2 beschreibt, wie die Injektion Mischung aus jedem gereinigten DNA zur Injektion zu schaffen.
   10. Lagerung bei -20 ° C. Nach dem Auftauen die Mischung inspritzung, Spin-down der Röhre bei 14.000 rpm für 5 Minuten, um Schmutzpartikel, dass die Injektionsnadel verstopfen können zu befreien.

Genetisches Material	Konzentration
PPA-EGL-4P:: gfp (SalI)	> 5 ng / ul (0.1-10ng/μl)
pRL3 (PstI)	> 1 ng / ul
gDNA PS312 (PstI + SalI)	> 60 ng / ul
dH 2 O	~
Total:	30 mu l

Tabelle 2. PPA-prl-1 Injektion Mischung

2. RNA-Interferenz: In vitro doppelsträngige RNA-Synthese

1. Verwenden PCR das Gen von Interesse zu verstärken. RHL091 5'-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 '(BamHI) und RHL092 5'-tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3 '(PstI-Stelle) wurden verwendet, um eine 464 bp genomischen Fragment (Position 3-466) aus dem pRL3 Vektor, der die PPA-prl-1 (tu92) Allel zu verstärken.
2. Digest des PCR-Produkts mit BamHI und PstI.
3. Ligieren des Fragments an BamHI / PstI pL4440 RNAi Fütterung Vektor ² verdaut.
4. Transformieren Sie die eingefügten Vektors in kompetente Zellen wachsen und sie auf Ampicillin LB-Medium-Platten (50 ug / ml).
5. Wählen Sie den erfolgreich eingeführten Vektors mittels PCR unter Verwendung der T7-Primer.
6. Verwenden Sie die T7 flankiert PCR-Produkt mit dem prl-1-Gen auf doppelsträngige RNA-dsRNA zu machen) mit der BLOCK-IT RNAi-Synthese-Kit (Invitrogen).
7. Die dsRNA-Konzentration ist am besten, wenn> 200 ng / ul, bis zu 1 ug / ul zur Injektion.
8. Lagerung bei -20 ° C. Nach dem Auftauen der Mischung zur Injektion, Spin-down der Röhre bei 14.000 rpm für 5 Minuten auf der Schmutzpartikel, dass die injectio verstopfen kann losn Nadel.

3. Mikroinjektion: Protokoll für die Injektion von Transgenen und / oder dsRNA

1. Injektionsnadeln
   1. Stellen Sie die Narishige Nadel-Abzieher (Modell #: PC-10) Temperatur:
      1. Schalten Sie unten Knopf auf "No.2 Heater".
      2. Drehen Sie den "No.2 Heater Adj." Knopf bis Panel liest 55,0-60,0 ° C für konische Nadelspitze mit unterschiedlichen Längen.
   2. Drehen Sie den unteren Knopf zurück zu "Schritt 1" (Pulls Nadel in einem Schritt).
   3. Laden Nadel in die Kammer und stellen Sie sicher, dass es sicher ist.
   4. Drücken Sie die Schaltfläche "Start" (rote Taste) und erlauben Nadel mit allen Gewichten (dies sollte zwei identischen Nadeln in entgegengesetzte Richtungen zu machen) gezogen werden.
   5. Entfernen Sie die Nadel aus der Kammer und speichern in einer Kunststoff-Platte Kultur anstelle von Play-Doh gesichert, dass Staub auf den Nadeln zu verhindern.
2. Montage-Pads
   1. In einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, machen Sie eine 2% Edle Agar solution durch Zugabe von 0,02 g Noble-Agar zu 1 ml H ₂ O. Der Agar kann bei 4 ° C gelagert werden bis zu einem Jahr.
   2. Nach gründlichem Mischen und Schmelzen Agar in einem Heizblock auf> 88 ° C.
   3. Mit einer 1 ml Mikropipette einen Tropfen Flüssigkeit 2% Edle Agar in die Mitte der Glasplatte (Fisher, 12 bis 544-F).
   4. Flatten, indem eine andere Glasplatte auf der Oberseite des Tropfens.
   5. Wiederholen Sie die "Drop Step", bis es eine Schicht von fünf Objektträger aus Glas.
   6. Nehmen Sie jede Glasplatte, indem Sie den Glasträger sich gegenseitig.
   7. Dry abflachen Agar-Pad auf Glasträger in einem Vakuumofen bei 70 ° C für 4 Stunden bis über Nacht (oder über Nacht bei Raumtemperatur).
   8. Machen Sie mehrere Injection Pads und speichern für zukünftige Verwendung.
3. Mikroinjektion in zwittrigen Gonaden

Abbildung 1. Eine schematische Zeichnung des P. pacificus anatschaft. Die klare kernhaltigen Zellen sind weibliche Keimzellen (Eizellen) und die grau unterlegten Teil ist der Darm. Nur eine distale vordere Gonaden wird angezeigt, aber bemerken die beiden distalen Gonaden einander kreuzen dorsal nahe Mitte Körper.

Abbildung 2. Bilder der Mikroinjektion. (A) Die Injektion Nadelspitze im Fokus mit der rechten Linie der Kapillare gezogen Stück. Durch leichtes Berühren der Spitze der Nadel, um die Kante, sollte die Nadelspitze zu brechen unter Beibehaltung einer scharfen Spitze. (B) Die Nadel-Einsätze in den oberen Gonade knapp über den Darm Krümmung für die erste Injektion. (C) Die Nadel-Einsätze in den unteren Gonaden knapp unterhalb der gut Krümmung für die zweite Injektion.

3. 1. Achten Sie darauf, den Kontrast und die DIC Scheren Einstellung ist ideal für das Betrachten des Hermaphroditen Keimdrüsen.
   2. Laden 1,0-2,0 ul der Injektion Mischung in die gezogenKapillarnadel.
   3. Stecken Sie die Nadel in die Mikroinjektion Manipulator, Manometer der Stickstoff-Tank sollte, um ideale Bedingungen (10-20 psi für 0,5-1 sec) eingestellt werden.
   4. Break the Nadelspitze durch Berühren leicht auf Rand einer dünn gezogen Kapillare auf einer Folie (Abbildung 2A) platziert.
      1. Needle Leistungsschalter slide: der dünnste Teil einer Kapillare gezogen platziert auf einem Glasträger in einem Tropfen Öl
   5. Sobald die Nadel gebrochen ist, kann vorhanden sein, um eine Ruhelage, während Sie Ihre Wurm holen, um das Pad (P. pacificus eine 5 Minuten-Fenster für die Injektion, bevor sie trocken-out und sterben).
   6. Mit einem Teller voller J4-jungen erwachsenen Würmer, pour genug Paraffinöl (schwer), nur alle die Würmer in OP50 Bakterienrasen.
   7. Wählen Sie ein Wurm und legen Sie es auf die Injektion Pad.
   8. Legen Sie die Objektträger aus Glas mit dem Wurm unter dem Mikroskop; Position des Wurms Gonade in Richtung der Nadel und der Vulva weg von der Notwendigkeitle (Abb. 2B, 2C).
   9. Senken Sie die Nadel in die Position des Mikroskops zu sehen.
   10. Position der Spitze Gonade und die Nadel in die gleiche Bildebene (Abbildung 2B).
   11. Poke der Wurm sanft und Pumpe in der Injektion Mischung; ooctyes Trennung in Richtung der distalen Spitze deuten auf eine erfolgreiche Injektion (Um Transgen oder dsRNA Lieferung zu optimieren, sollten Sie bei der Injektion sehen eine Welle der Expansion in den Keimdrüsen, die bis nahe an das distale ist weiterhin tip).
   12. Positionieren Sie die Nadel auf die untere Gonade und wiederholen Injektion injizieren, aber da diese Gonade unter dem Bauch der Verbreitung der Eizellen nicht sieht, und ist somit schwieriger zu erreichen (Abbildung 2C).
   13. Normal aussehenden Wurm deutet auf eine erfolgreiche Injektion nach der Injektion; sollte es keine beschädigten Gonaden werden (ragt aus der Vulva oder tauchte in der Körperhöhle).
   14. Stecken Sie die Nadel wieder in Ruhestellung.
   15. Bereiten Sie den Wurm zu retten.
   16. Fügen Sie einTropfen (0,5 ul) M9-Puffer auf das Pad, wo das injizierte Wurm platziert wird.
   17. Mit einigen OP50 Bakterien auf Ihre Wahl, berühren Sie den Wurm mit dem OP50, und es sollte halten. Wir verwenden keine Mund pipettieren.
   18. Setzen Sie den Wurm auf die Platte mit 50 ul Flecken OP50 ausgesät, können 2-4 Würmer auf solchen Platten gerettet werden.
4. Post-Injektion Storage & Screening für Transgenese
   1. Shop injiziert Würmer (P ₀₎ bei 20 ° C für ca. 4 Tage, um Eier zu legen und aufwachsen F _1.
   2. Screen-Würmer am vierten Tag für ausgewählte Phänotyp (Um-Bildschirm für Transgenese Suche nach rollende Tiere Ausdruck der PPA-prl-1 dominante Marker).
   3. Wählen Sie einzelne unabhängige F ₁ 's Tiere mit dem beobachteten Phänotyp zu neuen ausgesät Platte und lagern bei 25 ° C; dieser Temperatur fördert die Bildung von stabilen Linien von F _1' s.
   4. Einzel-F ₂ aus unabhängigen F _1-Linien. Individuelle F ₂ Linien haben ähnliche Transgen Übertragungsraten. Wir erhalten häufig> 15 F ₂ Zeilen pro verwandelt F ₁ Tier.
   5. Shop nachfolgenden Generationen bei 25 ° C.
   6. Die Übertragungsrate der Rollen bleibt in der Regel nach dem F _4-Generation konstant, so ist es zu dieser Zeit notwendig, um die Expression des Ziel-Transgen (PPA-EGL-4P:: gfp) ermitteln für jede einzelne Linie. GFP-Expression kann nicht mit dem Ausmaß der Penetranz der dominanten Rolle Phänotyp korrelieren.
5. Post-Injektion Storage & Screening für RNAi-Phänotypen
   1. Shop injiziert Würmer (P ₀₎ bei 20 ° C für ca. 4 Tage zu verlegen und zu wachsen F _1.
   2. Screen-F ₁ Würmer am vierten Tag für ausgewählte Phänotyp (Um-Bildschirm für RNAi-Knockdown Phänotyp, suchen Sie nach penetrant Phänotypen, die mit dem Verlust der Ziel-Gen-Aktivität in Verbindung gebracht werden, kann in unserem Fall den Verlust des PPA-prl-1 Phänotyp).
   3. Nach unserer Erfahrung ist die nicht-roller Knockdown Phänotyp in> 97% der F ₂ verloren.

4. Repräsentative Ergebnisse:

1. Ergebnis der Transgenese

Session	Injected P 0	F 1 Rollers	% Transgenen F 2	Durchschnittliche% Transmission nach F 2
1	60	2	(Linie 1) 0% (Linie 2) 13%	NA 13% ± 10
2	40	1 *	(Linie 3) 0%	NA
3	40	0	0%	NA
4	40	1	(Linie 4) 0%	NA
5	20	0	0%	NA
6	40	1	(Linie 5) 26%	22% ± 10

* Eine männliche Rolle, nicht überschreiten; NA: Nicht anwendbar

. Tabelle 3 Ergebnisse der injizierten PS312 mit PPA-EGL-4P:: gfp (Sal I verdaut), pRL3 (Rolle) (Pst I verdaut) und gDNA PS312 (PstI und SalI verdaut).

Abbildung 3 (A) Wildtyp (B, C) ​​eine stabile F ₄ pRL3; PPA-EGL-4p.:: Gfp transgene Linie zeigt den Kopf Neuron GFP-Expression.

2. Ergebnis der RNA-Interferenz

Abbildung 4. RNA injiziert prl-1-Mutantenzeigen komplette Knockdown von "rollenden" Fortbewegung. (A) prl-1 Rolle gain-of-function-Mutante tu92. (B) prl-1-Mutanten weisen eine normale Wildtyp-Haltung und Bewegung "abgerissen". (C) injiziert prl-1 (unten) hat auch mehr Körper als prl-1-Mutante (oben). (D) Die mehr Körper injiziert prl-1 (unten) ist auch mehr als der Wildtyp PS312 (oben). Je länger Körper Phänotyp wurde auch in den rol-5 (SQT-1) RNAi Knockdown von C beobachtet elegans N2 (Daten nicht gezeigt).

	rollen	Nicht-roll
Ein prl-1 dsRNA (200 ng / ul)	13	21
B prl-1 dsRNA (1000 ng / ul)	9	16
Steuerung	20	2

Tabelle 4. Zusammenfassung der PPA-prl-1 dsRNA Injektionen. (A) [dsRNA] = 200 ng / ul; (B) [dsRNA] = 1000 ng / ul. P = 0,0019 und 0,041 von Exact-Test nach Fisher, zweiseitig, für 200 und 1000 ng / ul Injektionen, jeweils.

Diskussion

P. pacificus Populationen sind in enger Zusammenarbeit mit verschiedenen Skarabäus Arten weltweit gefunden und ist ein Modell, Nematoden der Mitte zwischen frei lebenden und Nematoden. Die Stärke des P. pacificus als ein Modell Organismus lag in der Integration seiner genetischen und physikalischen Karten, die positionelle Zuordnung von Mutanten aus unvoreingenommene freuen genetischen Screens isoliert zu fördern (dh nicht nur für Kandidatengene zuvor in C. elegans charakterisiert...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Produkt:	Catalog #:	Lieferant:
DMI3000 Injection Mikroskop	DMI3000	Leica
Mikroinjektor Manipulator (Direct Drive)	Narashige BC-3 Kugelgelenk	Tritech Forschung
Needle Puller	Narashige PC-10	Tritech Forschung
Mikroinjektor ™ All-Digital Multi-Druck-System	Narashige Minj-D	Tritech Forschung
GeneElute ™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit	G1N70	Sigma
pJet Cloning Jet-Set	K1231	Fermentas
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	K0502	Fermentas
DNA Clean & Concentrator ™	D4005	Zymo Forschung
BLOCK-IT ™ RNAi TOPO ® Transcription Kit	K3500-01 & K3650-01	Invitrogen
Difco ™ Agar Edle	DF0142-15-2	Fisher Wissenschaftlich
Mikroskop Deckglas (1,5 bis 0,16 bis 0,19 mm dick, Größe: 50 x 45mm)	12 bis 554-F	Fisher Scientific
Glaskapillaren (Filament)	615000	AM-Systeme
Paraffinöl (Heavy)	O122-1	Fisher Scientific
KH 2 PO 4	P386-500	Fisher Scientific
Na 2 HPO 4	AC20651-5000	Fisher Scientific
NaCl	BP3581	Fisher Scientific
MgSO 4	M80-500	Fisher Scientific