RNAi mediata Knockdown Gene e Transgenesi dalla microiniezione nel nematode Necromenic Pristionchus pacificus</em

Riepilogo

In organismi modello, transgenesi in grado di manipolare le funzioni del gene, mentre RNAi può knockdown trascritti di mRNA specifico 1-2. Questo protocollo si propone di illustrare le tecniche necessarie per introdurre in modo stabile il DNA trasmessi e transitori di RNA a doppio filamento nel nematode necromenic Pristionchus pacificus Per gli studi in biologia evolutiva dello sviluppo, e comportamentali.

Abstract

Anche se è sempre più accessibili per gli organismi modello emergente di ottenere genomi completamente sequenziati, approfondita la funzione del gene e analisi di espressione di RNA interference e transgenesi stabile rimanere limitata in molte specie a causa della particolare anatomia e biologia cellulare molecolare dell'organismo. Per esempio, al di fuori del Caenorhabditis gruppo corona che comprende Caenorhabditis elegans ^3, stabilmente trasmesse in linee transgeniche non Caenorhabditis specie non sono stati riportati in questo phylum specioso (Nematodi), con l'eccezione di Strongyloides stercoralis Pristionchus pacificus ⁴ e ^5. Per facilitare il ruolo crescente del P. pacificus nello studio di sviluppo, l'evoluzione e il comportamento ^6-7, si descrivono qui i metodi attuali di utilizzare microiniezione per la produzione degli animali transgenici e gene abbattere da RNAi. Come le gonadi di P. pacificus è syncitial e capace di incorporare DNA e RNA in ovociti al momento della consegna da microiniezione diretta. A differenza di C. elegans tuttavia, l'ereditarietà transgene stabile e di espressione somatica in P. pacificus richiede l'aggiunta di DNA genomico digerito con endonucleasi di sé complementari alle estremità dei transgeni bersaglio e marcatori co-iniezione ^5. L'aggiunta di DNA genomico vettore è analoga a quella prescritta per l'espressione del transgene in Strongyloides stercoralis ⁴ e nelle cellule germinali di C. elegans. Tuttavia, non è chiaro se il requisito specifico per il DNA genomico proprio gli animali 'è perché P. pacificus soma è molto efficiente a tacere non complessi multi-copia dei geni o che gli array extracromosomico in P. pacificus richiedono sequenze genomiche per l'assemblaggio cinetocoro corretto durante la mitosi. La migrazione ventrale dei due bracci (didelphic) gonadi in ermafroditi complica ulteriormente la possibilità di iniettare in entrambe le gonadi vermi individuale ^8. Abbiamo anche dimostrare l'uso di microiniezione per knockdown un mutante dominante (rullo, tu92) iniettando RNA a doppio filamento (dsRNA) nelle gonadi di ottenere non rotolamento F ₁ progenie. A differenza di C. elegans, ma come la maggior parte di altri nematodi, P. pacificus PS312 non è ricettivo a sistemico RNAi attraverso l'alimentazione e ammollo e quindi dsRNA deve essere somministrato con microiniezione nelle gonadi syncitial. In questo studio, speriamo di descrivere il processo di microiniezione necessari per trasformare un PPA-EGL-4 promotore:: reporter di fusione GFP e knockdown un rullo dominante PRL-1 (tu92) mutante in un protocollo visivamente informativo.

Protocollo

1. Transgenesi: preparazione del DNA

1. Dominante co-iniezione marcatore: pRL3 [ppa-PRL-1 (tu92)]
   Il plasmide pRL3 è un dominante co-iniezione marker per individuare visivamente eventi di trasformazione di successo. Questo plasmide codifica per un allele mutante dominante (tu92) della PPA-PRL-1 gene strettamente correlata alla SQT-1 gene del collagene in C. elegans e trasforma il tipo selvatico locomozione sinusoidale movimenti di torsione in senso orario lungo il corpo del worm asse ^1,5. L'animale trasformato è molto simile al marcatore di selezione popolare dominante rol-6 (su1006) utilizzato in C. elegans negli ultimi 20 anni.
2. Obiettivo giornalista transgene: ppa-EGL-4p:: GFP
   Un gene di interesse possono essere collegati trascrizionalmente o traduzionali ad una sequenza codificante GFP ^9. In questo studio, il PPA-EGL-4promoter:: GFP (EGL-4, proteina chinasi cGMP dipendente) was usato per determinare se un frammento 2 kb a monte dell'inizio della traduzione può conferire espressione GFP in P. pacificus PS312. Questo vettore GFP contiene una regione codificante GFP modificato con
   introni il multiuso ppa-rpl-23 3 'UTR Terminator ⁵ gentilmente fornito da Xiaoyue Wang e Ralf J. Sommer (Max-Planck Institute, Tuebingen, Germania, UE). e
3. DNA genomico: PS312
   L'aggiunta di tipo selvatico P. pacificus DNA genomico PS312 è necessario per ottenere l'eredità transgene stabile, in particolare da animali transgenici F ₁ F ₂ alla loro progenie ^5. Non è ancora certo se il DNA genomico forme complesse array supplementare cromosomica con i due transgeni (la co-iniezione marcatore PRL-3 e la ppa-EGL-4p:: reporter GFP) simili a quelli osservati in stabile F ₂ linee transgeniche in C. elegans ^3. Tuttavia, l'obbligo di avere il DNA genomico e transgeni di condividere Identicasovrasta l coesa suggerisce fortemente la formazione di complessi extra-array cromosomico della cellula ospite può riconoscere per la trasmissione corretta di DNA (gDNA preparati utilizzando Sigma G1N10 kit).
4. Digestione del DNA
   Enzimi di restrizione sono usati per linearizzare il PPA-EGL-4p:: GFP DNA vettore e di produrre sbalzi appiccicoso compatibile con il marcatore pRL3 co-iniezione e PS312 gDNA. Mescolare agitando, non vortex. Incubare per un'ora a 37 ° C.

pRL3	4 microgrammi
10xbuffer	10 microlitri
PstI (10 U / mL)	4 microlitri
dH 2 O	~
Totale:	100 ul
Ppa-EGL-4p:: GFP	4 microgrammi
Tampone 10x	10 microlitri
Sali (10 U / mL)	4 microlitri
dH 2 O	~
Totale:	100 ul
gDNA PS312	10 mcg
Tampone 10x	10 microlitri
Pst I e Sal I (10 U / mL)	8 microlitri
dH 2 O	~
Totale:	100 ul

Tabella 1. Miscela di enzimi di restrizione Digest.

5. DNA precipitazioni e preparazione
   1. Aggiungi acetato di sodio 1:10 (3 M NaCOOCH ₃ pH 5,2) e 2,5 volte il volume del 100% di etanolo al al prodotto digerito; aggiungere 20 ng / l di glicogeno per vedere pellet più facile.
   2. Centrifugare a14.000 rpm per 15 minuti a 4 ° C.
   3. Decantare il surnatante tramite ribaltamento lentamente la provetta a testa in giù e toccando su una carta velina, facendo in modo che il pellet è sicuro nell'angolo in basso del tubo e privo di etanolo.
   4. Aggiungere 1 ml di etanolo 75%.
   5. Immediatamente girare a 14.000 giri al minuto per 5 minuti a 4 ° C.
   6. Decantare il surnatante tramite lentamente ribaltamento della provetta a testa in giù e toccando su una carta velina facendo in modo che il pellet è custodito l'angolo inferiore del tubo e privo di etanolo.
   7. Secco pellet in centrifuga a vuoto a 14.000 rpm per 5 minuti a 25-30 ° C, fino a secco e completamente privo di etanolo.
   8. Aggiungere 30 ml di TE o sterili dH ₂ O e lasciare per una notte a 4 ° C prima brevemente mescolando con un vortice.
   9. La tabella 2 descrive come creare la miscela di iniezione per ogni DNA purificato per l'iniezione.
   10. Conservare a -20 ° C. Dopo lo scongelamento la miscela nelproiezione, spin down del tubo a 14.000 rpm per 5 minuti per eliminare particelle di detriti che potrebbero ostruire l'ago di iniezione.

Materiale genetico	Concentrazione
Ppa-EGL-4p:: GFP (Sali)	> 5 ng / mL (0.1-10ng/μl)
pRL3 (PstI)	> 1 ng / mL
gDNA PS312 (PstI + Sali)	> 60 ng / mL
dH 2 O	~
Totale:	30 microlitri

Tabella 2. Miscela ppa-PRL-1 iniezione

2. RNA Interference: In sintesi in vitro di RNA a doppio filamento

1. Usa PCR per amplificare il gene di interesse. RHL091 5'-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 '(Sito BamHI) e RHL092 5'-tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3 '(sito PstI) sono stati utilizzati per amplificare un frammento di 464 bp genomico (posizione 3-466) dal vettore pRL3 contenente il PPA-PRL-1 (tu92) allele.
2. Digerire il prodotto di PCR con BamHI e PstI.
3. Legare il frammento BamHI / PstI digerito pL4440 RNAi alimentazione vettore ^2.
4. Trasformare il vettore inserito in cellule competenti e farle crescere in piastre di LB ampicillina mezzi di comunicazione (50 mcg / ml).
5. Selezionare il vettore inserito con successo mediante PCR utilizzando i primer T7.
6. Utilizzare il T7 affiancato prodotto di PCR contenente il PRL-1 gene per fare RNA a doppio filamento dsRNA) utilizzando il BLOCCO-IT RNAi sintesi kit (Invitrogen).
7. La concentrazione dsRNA è meglio se> 200 ng / mL, fino a 1 mg / mL per l'iniezione.
8. Conservare a -20 ° C. Dopo lo scongelamento la miscela per iniezione, rotazione verso il basso il tubo a 14.000 rpm per 5 minuti per liberarsi di particelle di detriti che potrebbero ostruire il injection ago.

3. Microiniezione: protocollo per l'iniezione dei transgeni e / o dsRNA

1. Aghi di iniezione
   1. Impostare il Narishige ago estrattore (modello #: PC-10) temperatura:
      1. Ruotare la manopola in basso a "Heater No.2".
      2. Girare il "Adj riscaldatore No.2". manopola fino a pannello legge 55,0-60,0 ° C per la punta dell'ago conici di varie lunghezze.
   2. Ruotare la manopola in basso torna a "Fase 1" (Tira ago in un passo).
   3. Carico ago nella camera e assicurarsi che sia sicuro.
   4. Premere il pulsante "Start" (tasto rosso) e consentire l'ago di essere tirato con tutti i pesi (questo dovrebbe fare due aghi identiche in direzioni opposte).
   5. Rimuovere l'ago dalla camera e conservare in una piastra di coltura di plastica fissata in posizione di Play-Doh per evitare l'accumulo di polvere sugli aghi.
2. Pad di montaggio
   1. In una provetta da 1,5 ml centrifuga, fare una solutio 2% Agar Noblen con l'aggiunta di 0,02 g di Agar Noble a 1 ml di H ₂ O. L'agar possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di un anno.
   2. Mescolare accuratamente e si fondono agar in un blocco di calore impostato> 88 ° C.
   3. Usando una micropipetta da 1 ml, una goccia di liquido Agar 2% Nobile al centro del vetrino (Fisher, 12-544-F).
   4. Appiattire mettendo un'altra lastra di vetro sulla parte superiore della goccia.
   5. Ripetere il "Passo Drop" fino a quando non vi è uno strato di cinque vetrini.
   6. Rimuovere ogni vetrino facendo scorrere il vetro scivola a vicenda.
   7. Secco appiattire pad agar su vetrini in un forno sotto vuoto a 70 ° C per 4 ore per notte (oa temperatura ambiente per una notte).
   8. Fai pastiglie di iniezione multipla e conservare per un uso futuro.
3. Microiniezione in gonadi ermafrodite

Figura 1. Un disegno schematico della P. pacificus Anatnomia. Le cellule chiare nucleate sono cellule germinali femminili (ovociti) e la parte in grigio è l'intestino. Solo una gonade distale anteriore è mostrato a meno di notare le due gonadi distale si incrociano dorsalmente vicino a metà del corpo.

Figura 2. Immagini di microiniezione. (A) La punta dell'ago iniezione è a fuoco con la linea più a destra del pezzo tirato capillare. Con una leggera toccando la punta dell'ago al bordo, la punta dell'ago si dovesse rompere, pur mantenendo una punta acuminata. (B) Gli inserti ago nella parte superiore gonade appena sopra la curvatura budella per la prima iniezione. (C) Gli inserti ago nel fondo gonade appena sotto la curvatura budella per la seconda iniezione.

3. 1. Assicurarsi che il contrasto e la tosatura DIC impostazione è ideale per visualizzare le gonadi ermafrodita.
   2. Carico 1,0-2,0 ml di miscela di iniezione nella tiratocapillare ago.
   3. Posizionare l'ago nel manipolatore microiniezione, misuratori di pressione del serbatoio di azoto deve essere impostato a condizioni ideali (10-20 psi per 0,5-1 sec).
   4. Rompere la punta dell'ago toccandolo leggermente a bordo di un tubo sottile tirato capillare posto su un vetrino (figura 2A).
      1. Ago scorrere interruttore: la parte più sottile di un capillare tirato posto su un vetrino in una goccia d'olio
   5. Una volta che l'ago è rotto può essere posto ad una posizione del minimo, mentre si scegli il tuo verme al pad (P. pacificus hanno una finestra 5 minuti per l'iniezione prima che si secchi-out e morire).
   6. Utilizzando un piatto pieno di J4-giovani vermi adulti, versare l'olio di paraffina abbastanza (pesante) per coprire appena tutti i vermi in OP50 prato batterica.
   7. Scegli un verme e posizionarlo sulla rampa di iniezione.
   8. Posizionare il vetrino con il worm sul microscopio; posizione delle gonadi del verme in direzione dell'ago e la vulva dalla necessitàle (Figura 2B, 2C).
   9. Abbassare l'ago in a posizione della vista microscopio.
   10. Posizione della gonade in alto e l'ago sullo stesso piano focale (Figura 2B).
   11. Poke il worm delicatamente e la pompa nella miscela di iniezione; ooctyes separa verso la punta distale indicano una iniezione di successo (Per ottimizzare il transgene o consegna dsRNA, si dovrebbe vedere un seguito di iniezione ondata di espansione della gonade che continua fino a quando non è vicino al distale punta).
   12. Riposizionare l'ago per iniettare alla gonade inferiore e iniezioni ripetute, ma poiché questo gonade è sotto l'intestino la diffusione degli ovociti non sarà visto ed è quindi più difficile da raggiungere (Figura 2C).
   13. Normale verme alla ricerca indica una iniezione di successo dopo l'iniezione, non ci dovrebbe essere alcun gonadi danneggiato (che sporge fuori dalla vulva o schioccato all'interno della cavità del corpo).
   14. Posizionare l'ago in posizione di riposo.
   15. Preparatevi a salvare il worm.
   16. Aggiungere uncalo (0,5 mL) di tampone M9 sul tampone dove si trova il worm iniettato.
   17. Utilizzando alcuni OP50 batteri sulla tua scelta, toccare il worm con l'OP50, e dovrebbe bastone. Non usiamo pipetta a bocca.
   18. Posizionare il worm sulla piastra seminata con 50 punti l di OP50, 2-4 worm possono essere salvati su piatti del genere.
4. Post-iniezione di stoccaggio e di screening per transgenesi
   1. Conservare iniettato vermi (P ₀₎ a 20 ° C per ~ 4 giorni di tempo per deporre le uova e crescono F _1.
   2. Vermi schermo il quarto giorno di fenotipo selezionato (Per schermo per transgenesi, la ricerca di animali rotolamento esprimere la ppa-PRL-1 marcatore dominante).
   3. Scegli singolo indipendente F ₁ 'animale s con il fenotipo osservato alla piastra nuove teste di serie e conservarlo a 25 ° C, questa temperatura favorisce la formazione di linee stabili da F _1' s.
   4. F singolo ₂ da indipendente F ₁ linee. Individuale F ₂ avere simili tassi di trasmissione transgene. Noi spesso ottenere> 15 F ₂ linee per trasformare F ₁ animale.
   5. Conservare le generazioni successive a 25 ° C.
   6. La velocità di trasmissione dei rollers di solito rimane costante dopo la generazione F _4, per cui è necessario in questo momento di determinare il livello di espressione del transgene bersaglio (PPA-EGL-4p:: GFP) per ogni singola linea. Espressione di GFP non è necessariamente correlato l'entità della penetranza del fenotipo dominante rullo.
5. Post-iniezione di stoccaggio e di screening per fenotipi RNAi
   1. Conservare iniettato vermi (P ₀₎ a 20 ° C per ~ 4 giorni per definire e far crescere F _1.
   2. Schermo F ₁ vermi il quarto giorno di fenotipo selezionato (Per schermo per fenotipo knockdown RNAi, ricerca di fenotipi penetranti che possono essere associati con la perdita di attività del gene bersaglio, nel nostro caso la perdita della PPA-PRL-1 fenotipo).
   3. Nella nostra esperienza, il non-roller fenotipo knockdown si perde in> 97% della F _2.

4. Rappresentante dei risultati:

1. Risultato della transgenesi

Sessione	Iniettato P 0	F 1 Rulli	% Transgenico F 2	% Medio di trasmissione dopo la F 2
1	60	2	(Linea 1) 0% (Linea 2) 13%	NA 13% ± 10
2	40	1 *	(Linea 3) 0%	NA
3	40	0	0%	NA
4	40	1	(Linea 4) 0%	NA
5	20	0	0%	NA
6	40	1	(Linea 5) 26%	22% ± 10

* Un rullo maschio che non ha attraversato; NA: Non applicabile

Risultati della tabella 3 PS312 iniettato con PPA-EGL-4p.:: GFP (Sal ho digerito), pRL3 (rullo) (Pst ho digerito), e gDNA PS312 (PstI e Sali digerito).

Figura 3 (A) tipo selvatico (B, C) ​​Una stabile F ₄ pRL3; ppa-EGL-4p.:: GFP linea transgenica mostrando espressione testa neurone GFP.

2. Risultato di interferenza dell'RNA

Figura 4. RNA iniettato prl-1 mutantimostrano knockdown completa di locomozione "rolling". (A) PRL-1 a rulli guadagno di funzione mutante tu92. (B) "abbattuto" prl-1 mutante postura tipo selvatico normale esporre e locomozione. (C) iniettata PRL-1 (in basso) è anche più lungo corpo di prl-1 mutante (in alto). (D) Il corpo più del iniettato PRL-1 (in basso) è anche più lungo del PS312 tipo selvatico (in alto). Il fenotipo corpo più a lungo è stata osservata anche nel rol-5 (SQT-1) knockdown RNAi di C. elegans N2 (dati non riportati).

	rotolo	non-roll
A prl-1 dsRNA (200 ng / mL)	13	21
B prl-1 dsRNA (1000 ng / mL)	9	16
controllo	20	2

Tabella 4. Riepilogo della PPA-PRL-1 dsRNA iniezioni. (A) [dsRNA] = 200 ng / mL; (B) [dsRNA] = 1000 ng / mL. P = 0,0019 e 0,041 per il test esatto di Fisher, a due code, per 200 e 1000 iniezioni ng / mL, rispettivamente.

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Discussione

P. popolazioni pacificus si trovano in stretta associazione con varie specie scarabeo tutto il mondo ed è un nematode modello intermedio tra il vivere libero e nematodi parassiti. La forza del P. pacificus come organismo modello emergente laici nella integrazione delle sue mappe genetiche e fisiche che promuovono la mappatura della posizione di mutanti isolati da imparziali schermi in avanti genetico (cioè non solo per geni candidati precedentemente caratterizzato in C. elegans)...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Prodotto:	Catalog #:	Fornitore:
DMI3000 iniezione microscopio	DMI3000	Leica
Microinjector manipolatore (in presa diretta)	Narashige congiunto AC-3 palle	Tritech di ricerca
Ago Puller	Narashige PC-10	Tritech di ricerca
MicroInjector ™ All-Digital Multi-pressione di sistema	Narashige Minj-D	Tritech di ricerca
GeneElute ™ mammiferi Genomic DNA Kit Miniprep	G1N70	Sigma
pJet Clonazione Jet kit	K1231	Fermentas
GeneJET plasmide Miniprep kit	K0502	Fermentas
DNA Clean & Concentrator ™	D4005	ZYMO ricerca
BLOCK-IT ™ RNAi TOPO ® kit di trascrizione	K3500 & K3650-01-01	Invitrogen
Difco Agar ™ Noble	DF0142-15-2	Fisher scientifi
Microscopio vetro di copertura (1,5 - 0,16 a 0,19 millimetri di spessore; Dimensioni: 50 x 45mm)	12-554-F	Fisher Scientific
Vetro capillari (filamento)	615000	AM sistemi
Olio di paraffina (pesante)	O122-1	Fisher Scientific
KH 2 PO 4	P386-500	Fisher Scientific
Na 2 HPO 4	AC20651-5000	Fisher Scientific
NaCl	BP3581	Fisher Scientific
MgSO 4	M80-500	Fisher Scientific