代谢途径的确认和发现通过 13 C - Proteinogenic氨基酸的标签

摘要

C - ¹³同位素标记是一个有用的技术，确定各类微生物细胞中央代谢。后已与一个特定的标记底物培养的细胞，气相色谱 - 质谱测量，可以揭示proteinogenic氨基酸的独特标签模式为基础的功能代谢途径。

摘要

微生物可以利用生物化学和功能基因组学方法研究复杂的代谢途径。一个重要的技术，来研究细胞中央的新陈代谢，并发现新^的酶是13的C -辅助代谢分析1。这种技术是基于同位素标记，用^{13 C}标记底物的微生物美联储。通过跟踪在生化网络代谢物之间的原子过渡路径，我们可以判断功能的途径，并发现新的酶。

作为辅助方法，转录和蛋白质组学，isotopomer辅助代谢途径分析方法包含三个主要步骤： 首先 ，我们的成长与^{13 C}标记底物的细胞。在这一步，中期和标记底物的选择组成的两个关键因素。为了避免从非标在营养补充剂的碳测量噪音与一个唯一碳源的培养基是必需的。此外，选择一个标记底物的基础上，如何有效地将澄清所分析的途径。由于新的酶往往涉及不同的反应的立体化学或中间产品，在一般情况下，单独标记的碳基板更新颖的途径检测信息统一标记的检测^{新颖的途径} 3，4，第二，我们分析氨基酸的标签模式，采用GC - MS。氨基酸丰富的蛋白质，并，从而可以从生物质水解获得。氨基酸可GC分离之前的N -（叔丁基二甲基）- N - methyltrifluoroacetamide（TBDMS）衍生。 TBDMS衍生的氨基酸可分散MS和在不同的片段阵列。费（M / Z）零散和不分段氨基酸的比例群众的基础上，我们可以推断可能是中央的代谢产物的标记模式氨基酸的前体。第三，我们在建议的途径跟踪13C碳过渡，isotopomer数据的基础上，确认这些途径^是否活跃2。氨基酸的测量提供了约8个中央代谢的关键前体代谢产物的同位素标记信息。这些代谢的关键节点，能反映相关中央通路的功能。

¹³的C协助通过proteinogenic氨基酸的代谢分析，可广泛用于低的特点微生物代谢功能特性。在这个协议中，我们将使用模型应变Cyanothece 51142证明标记的碳基板发现新酶功能的使用。

研究方案

1。细胞培养（图1）

1. 生长在培养基细胞与微量元素，无机盐，维生素，并特别标明的碳基板是最佳途径调查。要么摇瓶或生物反应器细胞培养使用。有机营养物质，如酵母提取物，可能会干扰测量氨基酸的标签，因此不能在培养基中。
2. 文化在一个最佳的波长（例如，外径₇₃₀ Cyanothece 51142）的光密度与紫外/可见分光光度计监测细胞的生长。
3. 可以先进行细胞生长在一个非标记的媒介。中间日志生长期细胞接种量接种率（3％（V / V））的标记介质​​的首选。标记的文化应该是在同一标记的介质，从最初的接种，以避免非标记的碳子培养（3％V / V接种比例）。

2。氨基酸提取

1. 收获子培养的细胞液（10ml）在中间通过离心（10分钟，8000 ×克）日志增长阶段。
2. 6M盐酸1.5ml的悬浮颗粒，并转移到一个透明的玻璃，螺丝顶GC小瓶。第小瓶，放置24小时，他们在100 ° C烘箱生物量的蛋白质水解成氨基酸。生物质颗粒的水解可以产生20种常见氨基酸（图^2）5 16 。半胱氨酸和色氨酸被降解，谷氨酰胺和天门冬酰胺，谷氨酸和天门冬氨酸，分别被转换。
3. 氨基酸溶液在20000 × g下离心5分钟用2毫升Eppendorf管，上清转移到新的GC小瓶。这一步水解液中删除的固体颗粒。
4. 卸下GC小瓶盖子和样品完全干下的空气流使用一个的Thermo Scientific Reacti - VAP蒸发器（注：冷冻干燥机，也可以采用tO）干样。这一步可以一蹴而就。

3。氨基酸衍生GC - MS条件

氨基酸或充电/高度极性的代谢产物通过气相色谱分析要求，这些代谢物的衍生物，使氨基酸波动，并可以由气相^色谱 2分离。

1. 溶于四氢呋喃（THF）与150μL和150μL的N -（叔丁基二甲基）N - methyltrifluoroacetamide衍生化试剂的干燥样品。
2. 所有样品° C为1小时65和80之间的烤箱或水浴孵育。涡偶尔确保样品瓶中的代谢产物被溶解。
3. 样品在20000 × g离心10分钟，然后将上清转移到新的GC小瓶。上清应该是一个明确的和黄的解决方案。由于探测器的饱和度，气相色谱 - 质谱测量精度可能会受到高concentration注入TBDMS衍生氨基酸（这些样品往往显示深褐色），因此，我们应该淡化这些样品使用四氢呋喃前的GC - MS测量^6。
4. 分析样品的GC - MS（1:5或1:10的分光比，注射量= 1μL，载气为氦气= 1.2毫升/分钟）。使用下面的GC程序升温：保持在150 ° C 2分钟，增加3 ° C每分钟到280 ° C，增加在20 ° C每分钟300 ° C，然后按住5分钟。溶剂延迟可以设置为〜5分钟（30米GC柱）。质量电荷比（M / Z）在MS范围可设置在60和500之间。

4。 GC - MS数据分析

1. TBDMS衍生氨基酸的测量，也可以受GC分离同位素歧视。轻同位素移动速度稍快比GC柱升沉同位素。为了减少潜在的测量偏差，我们可能平均整个质谱氨基酸峰值范围⁶
2. 气相色谱和质谱TBDMS衍生代谢物已报告⁷日前。 GC保留时间，并为每个氨基酸独特的M / Z峰，如图3所示。
3. 氨基酸或中央代谢产物的衍生引入了大量包括自然^标记同位素^{13℃（1.13％），18 O（0.20％），29 SI（4.70％），}和30的Si（3.09 ％）。从原料质量isotopomer频谱的天然同位素的测量噪声可以修正通过发布^{的软件5，} 8。最后的同位素标记数据报告质量分数，例如_{，M 0，M 1，M 2，M} 3 _和 M 4（代表包含零^4个 13 C标记的碳的片段）。
4. 氨基酸的测定，可提供约8个关键的前体代谢物同位素标记信息：2 - 羰基- glutar吃了，3 - P -甘油，乙酰辅酶A，erythrose - 4 - P，草酰乙酸，磷酸，丙酮酸，和核糖- 5 - P。这些代谢产物的标签模式可以被用来确定几个中央代谢途径（图^2）9。标记实验的结果可以得到进一步证实，用生物化学方法（如RT - PCR）。

5。使用标记的氨基酸数据的途径分析

通过调查只有少数关键从精心设计的^{13 C}示踪实验制作的氨基酸，我们可以发现几个独特的途径或酶的活动，而无需^执行复杂13的C代谢通量分析整个中央代谢。

1. 恩特纳Doudoroff途径：[1 - ^{13 C]}葡萄糖作为碳源。如果通路被激活，丝氨酸标签将明显比¹⁰丙氨酸标签。
2. 支TCA循环：[1 - ¹³ C]丙酮酸，可作为碳源。如果TCA循环被打破，天门冬氨酸，可以由两个碳原子标记，而谷氨酸是只有一个碳^11，12标记。
3. CO ₂固定在混合营养代谢卡尔文-本森Bassham周期：非标记的CO ₂和标有碳基板都被用作碳源。如果卡尔文循环功能，丝氨酸和组氨酸标签将被显著稀释，比其他氨基酸。这种方法可以相对确定的_CO 2固定时，有机碳的来源，目前^在中13。
4. 氧化磷酸戊糖途径：[1 - ^{13 C]}葡萄糖作为碳源。如果通路被激活，非标丙氨酸将大于^{50％，12。}
5. Anaplerotic途径（例如，人教版+ CO _{2 A}草酰乙酸^）：13 CO ₂和非标记的碳基板（例如，甘油或PYRuvate）可以用来作为碳源。如果途径是积 ​​极的，天门冬氨酸标签将显著丰富，比较丙氨酸^，丝氨酸13。
6. 重新柠檬酸合酶：[1 - ^{13 C]}丙酮酸，可作为碳源使用。如果激活酶，谷氨酸标记β-羧基^3，4。
7. Citramalate途径：[1 - ¹³ C]丙酮酸，[2 - ¹³ C]甘油，或[1 - ¹³彗星]醋酸可作为碳源。如果通路被激活，亮氨酸和异亮氨酸标签的金额是相同^的 14 。
8. 丝氨酸-异柠檬酸裂合酶循环：[1 - ¹³ C]丙酮酸或[1 - ¹³彗星]乳酸可以作为碳源。如果通路被激活，在第三的位置碳丝氨酸将被标记为^15。
9. 利用营养素（即外源性氨基酸）：一个完全标记的碳基板和非标记的氨基酸的培养基可以使用。如果细胞选择性地利用这些非标补充养分，我们将看到这些氨基酸在生物量的显著标签稀释。这种方法可以用来研究细胞¹⁶首选营养补充剂。

6。代表性的成果

最近生物能源的研究，在使用新的光合微生物的生物能源生产_恢复的利益和CO 2捕获。在过去的几年中，不少13C -代谢分析，包括先进的13C代谢通量分析（13C - MFA），已被应用于调查中央光合细菌的代谢，因为中央的代谢途径的生化知识是没有依据在这些非模型生物体^{10，11，17-20。}在这里，我们目前的一个备用异亮氨酸途径Cyanothece发现51142 ²¹的例子。青色othece 51142不含有酶（EC 4.3.1.19，苏氨酸氨酶），苏氨酸转化为2 - ketobutyrate催化典型的异亮氨酸合成途径。要解决的异亮氨酸的途径，我们成长在ASP2 ^中等 22 Cyanothece 51142（20毫升）与甘油（2 - 13C，> 98％）54毫米。Cyanothece 51142 ^采用了第二的位置标示为主要碳源的甘油。我们观察到，苏氨酸和丙氨酸有一个标记的碳，而异亮氨酸是与三个碳原子标记。因此，在Cyanothece 51142合成不能被来自受聘于大多数生物体（图4）中苏氨酸路线。另一方面，亮氨酸和异亮氨酸具有相同标签的基础上的片段模式（M - ^15）+片段（M - ^159）+ 。例如，从isotopomer数据[M - 15] ^+（含不分段氨基酸）相同的标签显示为亮氨酸（M0 = 0.01，货币供应量M1 = 0.03，M2 = 0.21，M3 = 00.69）和异亮氨酸（M0 = 0.01，M1 = 0.03，M2 = 0.24，M3 = 0.67）。因此，必须从相同的前体（即丙酮酸和乙酰辅酶A）合成亮氨酸和异亮氨酸。这个观察citramalate异亮氨酸合成途径中的标有“低碳转型是一致的。为了证实这一途径，我们搜索的联合基因组研究所数据库，并找到一个citramalate 合酶 CIMA（cce_0248） 在 Cyanothece存在。

图1 ^{13 C}辅助途径分析步骤。

图2用于收购其代谢的前体的标签模式的氨基酸。 ACOA，乙酰辅酶A; AKG，α-酮戊二酸; C5P，核糖-5 - 磷酸;企业所得税，柠檬酸; E4P，erythrose 4 - 磷酸; G6P，葡萄糖-6 - 磷酸;高龄津贴，草酰乙酸;人教版，磷酸;美巡赛，3 - 磷酸; PYR，丙酮酸。

图3。气相色谱峰为16个氨基酸。 TBDMS衍生氨基酸破获两个片段：由MS（M - 57），包含整个氨基酸，和（M - ^159）+，缺乏α氨基酸的羧基。亮氨酸和异亮氨酸，（M - 57）+其他的质谱峰重叠。我们建议使用片段（M - 15）+分析整个氨基酸标签。 （F302）+组进行检测，大多数氨基酸，其中包含仅在第（α-羧基组）和氨基酸骨干的第二个碳原子。因为这ms峰值往往具有较高的噪声信号的比值^{，（F302）+}不^建议 7代谢通量定量分析。

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图4。异亮氨酸途径Cyanothece 51142（从我们以前的文件修改^）21标签转换。

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讨论

该协议包括一个标记底物喂养的细胞，并测量通过GC - MS的氨基酸造成的同位素标记模式。由于MS数据（M / Z的比率），只是标签的MS离子的总金额，我们必须评估检查不分段（M - ^57）+的m / z比值和零散的氨基酸的氨基酸isotopomer分布（即（M - ^{159）+（F302））。}此外，我们可以执行几个细胞培养与化学相同的媒介，但有不同的标签模式^（1 ST标记的位置^，第二位置标示?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论（可选）
TBDMS	Sigma - Aldrich公司	19915	-
四氢呋喃	Sigma - Aldrich公司	34865	-
标有“碳源	剑桥同位素实验室	依赖对实验的要求	网址： http://www.isotope.com
气相色谱仪	安捷伦科技公司	惠普，型号7890A	-
气相色谱柱	J＆W科学，福尔瑟姆，CA	DB5（30米）	-
质谱仪	安捷伦科技公司	5975C	-
Reacti - VAP Evaporator	Thermo Scientific的	TS - 18825	对于干燥氨基酸样品