מסלול אישור דיסקברי מטבולית ודרך 13 C-תיוג של חומצות אמינו Proteinogenic

Summary

¹³ C-איזוטופ תיוג היא טכניקה יעילה לקביעת מטבוליזם התא מרכזי בסוגים שונים של מיקרואורגניזמים. אחרי תאים בתרבית כבר עם מצע שכותרתו ספציפיים, GC-MS המדידה יכול לחשוף מסלולים מטבוליים פונקציונלי המבוסס על דפוסי תיוג ייחודי חומצות אמינו proteinogenic.

Abstract

חיידקים יש מסלולים מטבוליים מורכבים שניתן לחקור בשיטות הגנומיקה ביוכימיה תפקודית. אחת הטכניקות חשוב לבחון מטבוליזם התא המרכזי לגלות אנזימים חדשים היא ¹³ C-בסיוע ניתוח חילוף החומרים 1. טכניקה זו מבוססת על תיוג איזוטופי, לפיה חיידקים ניזונים עם ¹³ ג שכותרתו מצעים. על ידי התחקות את המעבר בין הנתיבים אטום מטבוליטים ברשת ביוכימיים, אנו יכולים לקבוע מסלולים פונקציונלי לגלות אנזימים חדשים.

כפי שיטת משלים transcriptomics ו proteomics, גישות לניתוח isotopomer בסיוע של מסלולים מטבוליים מכילים שלושה שלבים עיקריים ^2. ראשית, אנו לגדל תאים עם ¹³ ג שכותרתו מצעים. בשלב זה, את ההרכב של המדיום ואת הבחירה של מצעים שכותרתו הם שני גורמים מרכזיים. כדי למנוע רעשים מדידת פחמן הלא מסומן תוספי תזונה, מדיום מינימלי עם מקור הפחמן היחידי הנדרש. יתר על כן, הבחירה של מצע שכותרתו מבוססת על כמה יעיל זה יהיה להבהיר את מסלול להיות מנותח. בגלל האנזימים רומן לעתים קרובות כרוך stereochemistry תגובה אחרת או מוצרי ביניים, באופן כללי, מצעים פחמן שכותרתו ביחידים הם אינפורמטיבי יותר לאיתור מסלולים רומן מאלה שכותרתו אחיד לגילוי מסלולים הרומן ^{3, 4.} שנית, אנו מנתחים את דפוסי חומצה אמינית תיוג באמצעות GC -MS. חומצות אמינו הן בשפע חלבון ולכן ניתן להשיג הידרוליזה ביומסה. חומצות אמינו ניתן derivatized על ידי N-(טרט-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) לפני ההפרדה GC. חומצות אמינו TBDMS derivatized יכול להיות מקוטעת על ידי MS והתוצאה במערכים שונים של שברים. בהתבסס על מסת יחס תשלום (m / z) של חומצות אמינו מקוטעת unfragmented, אנו יכולים להסיק את דפוסי שכותרתו אפשרית של מטבוליטים מרכזי, כי הםסימנים מקדימים של חומצות אמינו. שלישית, אנו מעברים עקבות הפחמן 13C את המסלולים המוצעים, בהתבסס על הנתונים isotopomer, לאשר מסלולים אלה הם ² פעילים. מדידה של חומצות אמינו מספק מידע תיוג איזוטופי כשמונה מטבוליטים מבשר חיוני במטבוליזם המרכזי. אלה צמתים מרכזיים מטבולית יכול לשקף את הפונקציות של מסלולים מרכזיים הקשורים.

¹³ C-בסיוע ניתוח חילוף החומרים באמצעות חומצות אמינו proteinogenic יכול להיות בשימוש נרחב לאפיון פונקציונלי של חילוף החומרים של חיידקים גרוע מאופיינים ^1. בפרוטוקול זה, נשתמש Cyanothece 51142 כמו מאמץ את המודל להדגים את השימוש מצעים פחמן שכותרתו לגילוי פונקציות האנזימטית חדש.

Protocol

1. Cell תרבות (איור 1)

1. לגדל תאים בינוניים מינימלי עם יסודות קורט, מלחים, ויטמינים, מצעים פחמן שכותרתו במפורש כי הם הטובים ביותר לחקירה מסלול. השתמש באחת צלוחיות רועד או bioreactors עבור התרבות התא. מזון אורגני, כגון תמצית שמרים, עלולה להפריע למדידת תיוג חומצת אמינו ולכן לא יכול להיות נוכח המדיום לתרבות.
2. מעקב צמיחת תאים על ידי צפיפות אופטית של התרבות באורך גל אופטימלי (למשל, OD ₇₃₀ עבור Cyanothece 51,142) עם ספקטרופוטומטר UV / Vis.
3. תאים יכולים להיות הראשון גדל בתווך הלא מסומן. באמצע-log השלב תאים הצמיחה הם העדיפו לשמש חיסון (3% (v / v) על ידי חיסון יחס נפח) של המדיום הנקרא. תרבות שכותרתו צריכה להיות תת תרבות (3% v / v יחס חיסון) במדיום שכותרתו אותו כדי למנוע את ההקדמה של פחמן שאינם שכותרתו מ inoculum הראשונית.

class = "jove_title"> 2. חומצות אמינו מיצוי

1. תת בתרבית תאים קציר (10 מ"ל) בשלב הביניים יומן הצמיחה על ידי צנטריפוגה (10 דק ', 8000 × ז).
2. Resuspend גלולה ב 1.5mL של 6M HCl ולהעביר אותו בכוס ברור, פקק הברגה בקבוקון GC. שווי צלוחיות למקם אותם בתנור 100 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי hydrolyze ביומסה את החלבונים לחומצות אמינו. הידרוליזה של כדורי ביומסה יכול להניב 16 מתוך 20 חומצות אמינו נפוצה (איור 2) ^5. ציסטאין טריפטופן מפורקים, ו גלוטמין ו asparagine מומרים גלוטמט aspartate, בהתאמה.
3. צנטריפוגה הפתרון חומצת אמינו ב 20,000 × g עבור 5 דקות באמצעות 2 מ"ל צינורות Eppendorf, ולהעביר את supernatants על צלוחיות חדש GC. צעד זה מסיר חלקיקים מוצקים בתמיסה הידרוליזה.
4. הסר את מכסי בקבוקון GC ויבש דגימות לחלוטין תחת זרם של אוויר באמצעות המדעית Thermo Reacti-VAP המאייד (הערה: מייבש להקפיא יכול לשמש גם לאo דגימות יבש). צעד זה יכול להיעשות בן לילה.

3. חומצת אמינו derivatization GC-MS התנאים

אנליזה של חומצות אמינו או טעונה / מטבוליטים מאוד קוטבי באמצעות GC מחייב מטבוליטים אלה להיות derivatized, כך חומצות אמינו הם נדיפים יכולים להיות מופרדים על ידי גז כרומטוגרפיה ^2.

1. ממיסים את דגימות מיובשות עם μL 150 של tetrahydrofuran (THF) ו 150 μL של N-מגיב (טרט-butyldimethylsilyl) N-methyltrifluoroacetamide-derivatization.
2. דגירה כל דגימות בתנור או אמבט מים בין 65 לבין 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. וורטקס מדי פעם כדי לוודא מטבוליטים בקבוקון הם מומס.
3. צנטריפוגה דגימות 20,000 × g עבור 10 דקות, ולאחר מכן להעביר את supernatant על צלוחיות חדש GC. Supernatant צריך להיות פתרון ברור צהבהב. בשל הרוויה של גלאי, GC-MS דיוק המדידה יכולה להיות מושפעת conce הגבוההntration של חומצות אמינו TBDMS מוזרק derivatized (דגימות אלה לעתים קרובות מראה צבע חום כהה), ולכן, אנחנו צריכים לדלל דגימות אלה באמצעות THF לפני GC-MS מדידה ^6.
4. ניתוח הדגימות על ידי GC-MS (או להשתמש 01:05 01:10 יחס מפוצל, נפח הזרקה = 1 μL, המוביל גז הליום = 1.2 mL / min). השתמש בתוכנית הבאה GC טמפרטורה: להחזיק ב 150 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, להגדיל ב 3 ° C לדקה עד 280 ° C, גידול ב 20 ° C לדקה עד 300 ° C, ולאחר מכן החזק במשך 5 דקות. עיכוב מרכך ניתן להגדיר כמו 5 דקות ~ (עבור עמודה GC 30 מטר). הטווח של המוני לחייב יחס (m / z) ב-MS יכול להיות מוגדר בין 60 ל 500.

4. GC-MS ניתוח נתונים

1. TBDMS חומצת אמינו derivatized המדידה יכולה להיות מושפעת גם על ידי אפליה איזוטופ בהפרדה GC. איזוטופים אור להזיז מעט מהר יותר מאשר תרומת איזוטופים בעמודה GC. כדי לצמצם את ההטיה המדידה פוטנציאל, אנו עשויים הממוצע הספקטרום המונית של כלחומצת אמינו שיא בטווח ⁶
2. GC ו-MS ספקטרום של מטבוליטים TBDMS derivatized דווחו לפני ^7. השעה השמירה GC ואת ייחודי מ '/ z פסגות עבור כל חומצת אמינו הן באיור 3.
3. Derivatization של חומצות אמינו או מטבוליטים מרכזי מציגה כמויות משמעותיות של איזוטופים טבעיים שכותרתו, כולל ¹³ C (1.13%), ¹⁸ O (0.20%), ²⁹ Si (4.70%), ו - ³⁰ Si (3.09%). הרעש מדידה של איזוטופים טבעיים הספקטרום המונית גלם isotopomer ניתן לתקן באמצעות תוכנת פרסם ^{5, 8.} הנתונים האחרונים תיוג איזוטופי מדווחים כשברים מסה, למשל, מ _0, M _1, M _2, M ₃ ו M ₄ (המייצגים שברים המכיל אפס עד ארבע C ¹³ פחמנים שכותרתו).
4. מדידה של חומצות אמינו יכול לספק מידע תיוג איזוטופי כשמונה מטבוליטים מבשר מכריע: 2-אוקסו-glutarאכל, 3-P-glycerate, אצטיל-CoA, erythrose-4-P, מוחדר, phosphoenolpyruvate, pyruvate, ריבוז ו-5-P. דפוסי תיוג של מטבוליטים אלה יכולים לשמש כדי לזהות מספר מסלולים מטבוליים המרכזי (איור 2) ^9. התוצאה של הניסויים תיוג ניתן לאשר המשך שימוש בשיטות ביוכימיה אחרים (למשל, RT-PCR).

5. מסלול מסומן באמצעות ניתוח נתונים חומצת אמינו

על ידי חוקרת רק חומצות אמינו כמה מפתח המופק מעוצב היטב ¹³ ניסויים C נותב, אנו עשויים לגלות מסלולים ייחודיים או פעילות אנזים ללא ביצוע מתוחכם ¹³ C-מטבולית ניתוח השטף של חילוף חומרים מרכזי כולו.

1. Entner-Doudoroff מסלול: ^[1-13 C] גלוקוז יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, תיוג סרין יהיה נמוך משמעותית מאשר תיוג אלאנין ב ^10.
2. מחזור TCA הקנים: ^[1-13 C]pyruvate יכול לשמש כמקור פחמן. אם מחזור TCA שבור, aspartate יכול להיות מתויג על ידי שני פחמנים, בעוד גלוטמט מתויג עם פחמן אחד בלבד ^{11, 12.}
3. CO ₂ קיבוע על ידי מחזור קלווין, בנסון, Bassham במטבוליזם mixotrophic: Non-CO ₂ שכותרתו ומסומן מצעים פחמן הן לשמש מקורות פחמן. אם מחזור קלווין הוא פונקציונלי, סרין וסימון היסטידין יהיה מדולל באופן משמעותי, בהשוואה חומצות אמינו אחרות. שיטה כזו יכולה לקבוע את הקיבעון היחסי CO _2, כאשר מקורות פחמן אורגני נמצאים ¹³ בינוני.
4. חמצוני מסלול pentose פוספט: ^[1-13 C] גלוקוז יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, אלאנין שאינו שכותרתו תהיה> 50% ^12.
5. מסלול Anaplerotic (למשל, PEP + CO ₂ מוחדר א): ¹³ CO ₂ ולא שכותרתו פחמן מצעים (למשל, גליצרול או pyruvate) יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, תיוג aspartate יהיה מועשר באופן משמעותי, בהשוואה אלאנין ו סרין ^13.
6. Re-citrate synthase: ^[1-13 C] pyruvate יכול לשמש כמקור פחמן. אם האנזים פעיל, גלוטמט הוא מסומן β-carboxyl קבוצה ^{3, 4.}
7. מסלול Citramalate: ^[1-13 C] pyruvate, ^[2-13 C] גליצרול, או ^[1-13 C] אצטט יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, כמויות תיוג לאוצין ו isoleucine זהים ^14.
8. סרין-isocitrate lyase מחזור: ^[1-13 C] pyruvate או ^[1-13 C] לקטט יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, פחמן העמדה השלישית סרין ותסומן ^15.
9. ניצול של חומרי מזון (כלומר, חומצות אמינו אקסוגניים): בינוני תרבות עם מצעים פחמן מסומן באופן מלא ולא מסומן חומצות אמינוניתן להשתמש בו. אם התאים לנצל באופן סלקטיבי חומרים אלה שאינם שכותרתו שיושלם, נוכל לראות דילול משמעותי של תוויות אלו חומצות אמינו ביומסה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור תוספי תזונה אשר עדיפים על ידי התא ^16.

6. נציג תוצאות

מחקרים אחרונים Bioenergy החיו אינטרסים באמצעות מיקרואורגניזמים phototrophic רומן לייצור Bioenergy ו-CO ₂ ללכוד. בשנים האחרונות, מעטים 13C-מטבוליזם ניתוחים, כולל 13C-מטבולית ניתוח מתקדמים שטף (13C-MFA), הוחלו על חילוף חומרים מרכזי לחקור חיידקים phototrophic, כי ידע ביוכימי של מסלולים מטבוליים המרכזי אינו מבוסס היטב אלה שאינם מודל אורגניזמים ^{10, 11, 17-20.} כאן, אנו מציגים דוגמה לגילוי מסלול isoleucine חלופית Cyanothece 51,142 ^21. ציאןothece 51142 אינו מכיל את האנזים (EC 4.3.1.19, תראונין אמוניה lyase), אשר מזרז את ההמרה של תראונין ketobutyrate-2 ב מסלול isoleucine טיפוסי סינתזה. כדי לפתור את מסלול isoleucine, אנו גדלים Cyanothece 51,142 (20 מ"ל) ב בינוני ASP2 ²² עם 54 mM גליצרול (2-13C,> 98%). Cyanothece 51142 מנצל 2 ^nd עמדה שכותרתו גליצרול כמקור פחמן הראשי. אנו צופים כי תראונין ו אלאנין אחד שכותרתו פחמן, בעוד isoleucine מתויג עם שלושה פחמנים. לכן, סינתזה ב Cyanothece 51142 לא ניתן להסיק תוואי תראונין המועסקים על ידי רוב האורגניזמים (איור 4). מצד שני, לאוצין ו isoleucine יש דפוסים זהים תיוג מבוסס על קטע (M-15) ⁺ ו שבר (M-159) ^+. לדוגמה, הנתונים isotopomer מ [M-15] ⁺ (המכיל חומצות אמינו unfragmented) להראות תיוג זהה לאוצין (M0 = .01, M1 = 0.03, 0.21 = M2, M3 = 00.69) ו isoleucine (M0 = .01, M1 = 0.03, 0.24 = M2, M3 = 0.67). לפיכך לאוצין ו isoleucine חייב להיות סינתזה של מבשרי אותו (כלומר, pyruvate ו אצטיל-CoA). הבחנה זו עולה בקנה אחד עם המעבר פחמן שכותרתו במסלול citramalate לסינתזה isoleucine. כדי לאשר את מסלול זה, אנו לחפש במאגר הגנום המשותפת במכון ולמצוא את נוכחותו של צ 'ימה synthase citramalate (cce_0248) ב Cyanothece.

באיור 1. ^C-13 סייעו ניתוח צעדים מסלול.

באיור 2. חומצות אמינו המשמשים לרכישת דפוס תיוג של מבשרי המטבולית שלהם. ACoA, אצטיל-CoA, AKG, α-Ketoglutarate; C5P, ריבוז 5 פוספט: CIT, ציטראט; E4P, erythrose 4-פוספט; G6P, גלוקוז 6 פוספט; OAA, מוחדר;, PEP phosphoenolpyruvate, PGA, 3-phosphoglycerate; PYR, pyruvate.

באיור 3. פסגות GC עבור 16 חומצות אמינו. חומצות אמינו TBDMS derivatized סדוקים ידי MS לשני קטעים: (M-57) ^+, המכיל את כל חומצות האמינו, ו (M-159) ^+, אשר חסר את הקבוצה carboxyl α של חומצה אמינית. עבור לאוצין ו isoleucine, + (M-57) היתה חפיפה על ידי פסגות המוני אחרים. אנו ממליצים להשתמש שבר (M-15) + לנתח את תיוג כל חומצת אמינו. הקבוצה (f302) + מזוהה חומצות אמינו ביותר, אשר מכיל רק את הראשון (α-carboxyl הקבוצה) ו פחמנים השני השדרה חומצת אמינו. כי זה שיא MS לעתים קרובות יש רעש גבוה ל-אות יחס, (f302) ⁺ לא מומלץ כמותי וניתוח והנתיבים מטבולית ^7.

igure 4 "/>
איור 4. תיוג מעברים במסלולים isoleucine ב Cyanothece 51,142 (שונה מנייר הקודמת שלנו) ^21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה כולל האכלה את התא עם המצע שכותרתו למדידת דפוסי כתוצאה תיוג איזוטופי של חומצות אמינו באמצעות GC-MS. מאז MS הנתונים (m / z יחסי) לתת בדיוק את הכמות הכוללת של תיוג של יונים MS, אנחנו צריכים להעריך את הפצות isotopomer של חומצות אמינו על ידי בחינת מ '/ z יחס של שני unfragmented (M-57...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
TBDMS	Sigma-Aldrich	19915	-
THF	Sigma-Aldrich	34865	-
פחמן תווית המצע	קיימברידג' איזוטופ מעבדות	לסמוך על הדרישה ניסיוני	אתר: http://www.isotope.com
גז כרומטוגרף	Agilent Technologies	Hewlett-Packard, דגם 7890A	-
GC עמודות	J & W מדעי, Folsom, CA	DB5 (30)	-
ספקטרומטר מסה	Agilent Technologies	5975C	-
Reacti-VAP Evaporator	Thermo Scientific	TS-18825	עבור ייבוש דגימות חומצת אמינו