Метаболический Подтверждение пути и Discovery Через 13 C-маркировки протеиногенных Аминокислоты

Резюме

¹³ С-изотопом маркировки полезным методом для определения ячейки центрального метаболизма для различных видов микроорганизмов. После клетки были культивировали с конкретными меченого субстрата, GC-MS измерение может выявить функциональные процессы обмена веществ на основе уникальных моделей маркировки в протеиногенных аминокислот.

Аннотация

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine cell central metabolism and discover new enzymes is ¹³C-assisted metabolism analysis 1. This technique is based on isotopic labeling, whereby microbes are fed with a ¹³C labeled substrates. By tracing the atom transition paths between metabolites in the biochemical network, we can determine functional pathways and discover new enzymes.

As a complementary method to transcriptomics and proteomics, approaches for isotopomer-assisted analysis of metabolic pathways contain three major steps ². First, we grow cells with ¹³C labeled substrates. In this step, the composition of the medium and the selection of labeled substrates are two key factors. To avoid measurement noises from non-labeled carbon in nutrient supplements, a minimal medium with a sole carbon source is required. Further, the choice of a labeled substrate is based on how effectively it will elucidate the pathway being analyzed. Because novel enzymes often involve different reaction stereochemistry or intermediate products, in general, singly labeled carbon substrates are more informative for detection of novel pathways than uniformly labeled ones for detection of novel pathways^{3, 4}. Second, we analyze amino acid labeling patterns using GC-MS. Amino acids are abundant in protein and thus can be obtained from biomass hydrolysis. Amino acids can be derivatized by N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) before GC separation. TBDMS derivatized amino acids can be fragmented by MS and result in different arrays of fragments. Based on the mass to charge (m/z) ratio of fragmented and unfragmented amino acids, we can deduce the possible labeled patterns of the central metabolites that are precursors of the amino acids. Third, we trace 13C carbon transitions in the proposed pathways and, based on the isotopomer data, confirm whether these pathways are active ². Measurement of amino acids provides isotopic labeling information about eight crucial precursor metabolites in the central metabolism. These metabolic key nodes can reflect the functions of associated central pathways.

¹³C-assisted metabolism analysis via proteinogenic amino acids can be widely used for functional characterization of poorly-characterized microbial metabolism¹. In this protocol, we will use Cyanothece 51142 as the model strain to demonstrate the use of labeled carbon substrates for discovering new enzymatic functions.

протокол

1. Клеточные культуры (рис. 1)

1. Рост клеток в минимальной среде с микроэлементами, солями, витаминами, и, в частности меченый углерод субстраты, которые лучше всего подходят для пути расследования. Используйте либо встряхивания колб или биореакторы для клеточной культуры. Органические питательные вещества, такие как экстракт дрожжей, может нарушать нормальное измерение аминокислоты маркировки кислоты и, следовательно, не могут присутствовать в культуральной среде.
2. Монитор рост клеток по оптической плотности культуры на оптимальную длину волны (например, О. Д. ₇₃₀ для Cyanothece 51142) с UV / Vis спектрофотометр.
3. Клетки могут быть сначала выращивают в немеченого среды. Среднего журнал клетки фазы роста являются предпочтительными для использования для прививок (3% (объем / объем) по объему прививки) меченого среды. Помечены культура должна быть суб-культурных (3% об. / прививки отношение) в той же меченой среды, чтобы избежать введения не-меченый углерод из исходного посевного.

2. Amino добычи кислоты

1. Урожай суб-культуре клеток (10 мл) в середине журнала фазы роста путем центрифугирования (10 мин, 8000 × г).
2. Ресуспендируют осадок в 1,5 мл 6 М HCl и перенести его на прозрачное стекло, завинчивающейся GC флаконе. Крышка флакона и поместите их в духовку 100 ° С в течение 24 часов для гидролиза биомассы белков на аминокислоты. Гидролиз биомассы гранулы могут дать 16 из 20 известных аминокислот (рис. 2) ^5. Цистеин и триптофан разлагаются, и глутамин и аспарагин преобразуются в глутамата и аспартата, соответственно.
3. Центрифуга аминокислоты раствора кислоты на 20000 х г в течение 5 мин с использованием 2 мл Eppendorf трубы, и передача супернатантах к новым ГК ампул. Этот шаг удаляет твердые частицы в гидролиза решение.
4. Удалить GC крышки флакона и сухие образцы полностью под поток воздуха с помощью Thermo Scientific реакционном Vap испарителя (примечание: замораживание сушилка может также использоваться то сухих образцов). Этот шаг можно сделать в одночасье.

3. Амино кислоты и производных GC-MS условиях

Анализ аминокислот или обвиняемого / сильно полярных метаболитов через ГК требует, чтобы эти метаболиты быть производные, так что аминокислоты являются неустойчивыми и могут быть разделены с помощью газовой хроматографии ^2.

1. Растворите высушенных образцов с 150 мкл тетрагидрофурана (ТГФ) и 150 мкл N-(трет-бутилдиметилсилил)-N-производных methyltrifluoroacetamide реагента.
2. Инкубируйте всех образцов в печи или на водяной бане между 65 и 80 ° С в течение 1 часа. Vortex иногда, чтобы убедиться, что метаболиты во флаконе, растворяют.
3. Центрифуга образцов при 20000 х г в течение 10 мин, а затем передать супернатант к новым ГК ампул. Супернатант должны быть четкими и желтоватый раствор. Из-за насыщения детекторы, GC-MS точность измерения могут быть затронуты высокие concentration вводимого TBDMS производные аминокислот (эти образцы часто показывает темно-коричневого цвета), поэтому мы должны разбавлять эти образцы на основе ТГФ до GC-MS измерения ^6.
4. Анализ образцов GC-MS (используйте соотношении 1:5 или 1:10 раскол, объемом впрыска = 1 мкл, газа-носителя гелия = 1,2 мл / мин). Используйте следующие температуры GC программы: проводить при температуре 150 ° С в течение 2 минут, увеличение на 3 ° С в минуту до 280 ° С, увеличение на 20 ° С в минуту до 300 ° С, а затем, удерживая в течение 5 минут. Растворитель задержка может быть установлен как ~ 5 мин (для 30-метровая колонна GC). Диапазон массы к заряду (м / г) в MS может быть установлен между 60 и 500.

4. ГХ-МС анализа данных

1. TBDMS производные аминокислот измерения кислота может также зависеть от изотопа дискриминации в отделение GC. Свет изотопы двигаться немного быстрее, чем бросать изотопов в колонку для ГХ. Для снижения вероятности смещения измерений, мы можем средний спектр масс целомаминокислоты диапазоне пик кислота ⁶
2. GC и MS спектры TBDMS производные метаболитов были зарегистрированы до ^7. GC время хранения и уникальные т / г пиков для каждой аминокислоты представлены на рисунке 3.
3. Производных аминокислот или центрального метаболитов представляет значительные объемы естественно меченных изотопами, в том числе ¹³ C (1,13%), ¹⁸ O (0,20%), ²⁹ Si (4,70%) и ³⁰ Si (3,09%). Измерение шума от природных изотопов в сыром спектр isotopomer массу можно исправить с помощью программного обеспечения опубликовал ^{5, 8.} Окончательный изотопные данные маркировки представлены как массовых долей, например, M _0, М _1, М _2, М ₃ и М ₄ (представляющих фрагменты, содержащие нуля до четырех ¹³ C меченых атомов углерода).
4. Измерение аминокислот может предоставить информацию изотопного маркировки около восьми важнейших метаболитов предшественником: 2-оксо-glutarели, 3-P-глицерат, ацетил-КоА, эритроза-4-Р, оксалоацетат, фосфоенолпирувата, пируват, и рибоза-5-P. Маркировке моделей в эти метаболиты могут быть использованы для идентификации нескольких центральных метаболических путей (рис. 2) ^9. Результаты экспериментов маркировки могут быть дополнительно подтверждена с помощью других методов биохимии (например, RT-PCR).

5. Путь анализа с использованием меченых аминокислот данные кислоты

Исследуя только несколько ключевых аминокислот производится из хорошо продуманных экспериментов ¹³ С трассирующими, мы можем выявить несколько уникальных путей или ферментативной активности, не выполняя сложные ¹³ C-метаболических потоков анализ всей центральной обмена веществ.

1. Энтнер-Doudoroff пути: [1 - ¹³ C] глюкозы может быть использован в качестве источника углерода. Если путь является активным, серин маркировки будет значительно ниже, чем маркировка в аланин ^10.
2. Разветвленная ЦТК: [1 - ¹³ C]пируват может быть использован в качестве источника углерода. Если ЦТК сломан, аспартат могут быть помечены двумя атомами углерода, в то время как глутамат обозначена только с одним углеродом ^{11, 12.}
3. CO ₂ фиксации Кальвина-Бенсона Bassham цикла в mixotrophic обмена веществ: Non-меченых CO ₂ и меченый углерод подложки и используются в качестве источников углерода. Если Кальвина цикл функциональной, серина и гистидина маркировки будет значительно разбавленный, по сравнению с другими аминокислотами. Такой метод может определить относительную фиксации CO _2, когда органические источники углерода присутствуют в среду ^13.
4. Окислительный фосфата пентозы пути: [1 - ¹³ C] глюкозы может быть использован в качестве источника углерода. Если путь является активной, без меток аланин будет> 50% ^12.
5. Заживляющий путь (например, ПКП + CO ₂ à оксалоацетат): ¹³ CO ₂ и не меченый углерод субстратов (например, глицерин или пирuvate) может быть использован в качестве источника углерода. Если путь является активным, аспартат маркировки будет значительно обогащается, по сравнению с аланин и серин ^13.
6. Re-цитрат-синтазы: [1 - ¹³ C] пирувата можно использовать в качестве источника углерода. Если фермент активен, глутамат обозначена в β-карбоксильная группа ^{3, 4.}
7. Citramalate пути: [1 - ¹³ C] пирувата, [2 - ¹³ C] глицерина, или [1 - ¹³ C] ацетат может быть использован в качестве источника углерода. Если путь является активным, лейцин и изолейцин количества маркировки идентичны ^14.
8. Серин-изоцитратлиазы цикла: [1 - ¹³ C] пирувата или [1 - ¹³ C] лактат можно использовать в качестве источника углерода. Если путь является активным, третий углерода позиции в серин будут помечены ^15.
9. Использование питательных веществ (например, экзогенных аминокислот): культуральная среда с полностью меченый углерод подложки и не-меченых аминокислотмогут быть использованы. Если клетки выборочно использовать эти дополнены без меток питательные вещества, то мы увидим значительное разбавление маркировке этих аминокислот в биомассе. Этот метод может быть использован для исследования пищевых добавок которые предпочитают ячейки ^16.

6. Представитель Результаты

Недавние исследования биоэнергии оживили интересы в использовании новых микроорганизмов фототрофных для производства биоэнергии и СО ₂ захвата. В последние годы немало 13С-метаболизм анализов, в том числе передовые 13С-Метаболический Flux анализа (13С-MFA), были применены для исследования центрального метаболизма в фототрофных бактерий, так как биохимические знание центральной метаболических путей не обоснованными В этих не модельных организмов ^{10, 11, 17-20.} Здесь мы приведем пример открытия альтернативный путь изолейцин в Cyanothece 51 142 ^21. Голубойothece 51142 не содержит фермент (EC 4.3.1.19, треонин аммиак-лиазы), которая катализирует превращение треонина в 2-ketobutyrate в типичный путь синтеза изолейцин. Для решения изолейцин пути, мы растем Cyanothece 51 142 (20 мл) в среду asp2 ²² с 54 мм глицерина (2-13С,> 98%). Cyanothece 51142 использует ^2-й позиции помечены глицерина в качестве основного источника углерода. Заметим, что треонина и аланина один меченый углерод, а изолейцин обозначена с тремя атомами углерода. Таким образом, синтез в Cyanothece 51142 не могут быть выведены из треонин маршрут занято большинство организмов (рис. 4). С другой стороны, лейцин и изолейцин имеют одинаковые шаблоны маркировки на основе фрагмента (М-15) ⁺ и фрагмент (М-159) ^+. Например, isotopomer данные из [М-15] ⁺ (содержащие нефрагментированной аминокислот) показывают идентичные маркировки лейцин (М0 = 0,01, M1 = 0,03, М2 = 0,21, М3 = 00,69) и изолейцин (М0 = 0,01, M1 = 0,03, М2 = 0,24, M3 = 0,67). Таким образом лейцин и изолейцин должны быть синтезированы из того же прекурсоры (например, пируват и ацетил-КоА). Это наблюдение согласуется с меченый углерод перехода в citramalate путь для изолейцин синтеза. Для подтверждения этого пути, мы ищем совместные генома Института базу данных и найти присутствии синтазы citramalate CIMA (cce_0248) в Cyanothece.

Рисунок 1. ¹³ C-помощь шагов пути анализа.

Рисунок 2. Аминокислоты используются для приобретения маркировки характер их метаболические предшественники. АКОА, ацетил-КоА, AKG, α-кетоглутарат; C5P, рибозы 5-фосфат, CIT, цитрат; E4P, эритроза 4-фосфат; G6P, глюкозо-6-фосфат; ОПД, оксалоацетат; PEP, фосфоенолпирувата; PGA, 3-фосфоглицерат; PYR, пирувата.

Рисунок 3. GC пики для 16 аминокислот. TBDMS производное аминокислоты взломан MS на два фрагмента: (М-57) ^+, содержащий всю аминокислоты, и (М-159) ^+, в котором отсутствуют α карбоксильной группой аминокислоты. Для лейцин и изолейцин, (М-57) + было перекрыто другими пиками массы. Мы рекомендуем использовать фрагмент (М-15) + проанализировать всю аминокислоты маркировки кислоты. (F302) + группы выявлены в большинстве аминокислот, который содержит только первый (α-карбоксильной группы) и второго атомов углерода в аминокислоты позвоночник кислоты. Потому что это MS пик часто имеет высокий шум-сигнал отношения, (f302) ⁺ не рекомендуется для количественного анализа метаболических потоков ^7.

igure 4 "/>
Рисунок 4. Маркировка переходов в изолейцин путей в Cyanothece 51 142 (с изменениями от нашей предыдущей работе) ^21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол состоит из кормления ячейки с меченого субстрата и измерения в результате изотопного шаблонов маркировки в аминокислоты с помощью ГХ-МС. Поскольку MS данные (т / г соотношениях) дают только общее количество маркировки ионов MS, мы должны оценить isotopomer распределения аминоки?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (необязательно)
TBDMS	Sigma-Aldrich	19915	-
ТГФ	Sigma-Aldrich	34865	-
Меченый углерод подложки	Изотопный Кембридже лаборатории	В зависимости от экспериментальной требование	Сайт: http://www.isotope.com
Газовый хроматограф	Компания Agilent Technologies	Hewlett-Packard, модель 7890A	-
GC Столбцы	J & W Научные, Фолсом, Калифорния	DB5 (30м)	-
Масс-спектрометра	Компания Agilent Technologies	5975C	-
Реакционном Vap Evaporратора	Thermo Scientific	TS-18825	Для сушки аминокислоты образцы кислоты