Percorso di conferma metaboliche e scoperta attraverso 13 C-etichettatura dei proteinogenici Aminoacidi

Riepilogo

¹³ C-isotopo etichettatura è una tecnica utile per determinare il metabolismo cellula centrale per vari tipi di microrganismi. Dopo che le cellule sono state coltivate con un substrato specifico etichettato, GC-MS di misurazione in grado di rivelare vie metaboliche funzionali basati su modelli di etichettatura unico nel proteinogenici aminoacidi.

Abstract

I microbi sono complesse vie metaboliche che possono essere indagati con metodi biochimica e genomica funzionale. Una tecnica importante esaminare il metabolismo centrale cellulare e scoprire nuovi enzimi è di ¹³ C-assistiti di analisi del metabolismo 1. Questa tecnica si basa sulla etichettatura isotopica, in cui sono alimentati i microbi con ¹³ substrati C etichettati. Tracciando i percorsi di transizione tra atomo metaboliti della rete biochimica, possiamo determinare i percorsi funzionali e scoprire nuovi enzimi.

Come metodo complementare alla trascrittomica e la proteomica, approcci per isotopomero assistita analisi delle vie metaboliche contengono tre fasi principali ^2. Per prima cosa, crescere le cellule con ¹³ substrati C etichettati. In questa fase, la composizione del mezzo e la selezione dei substrati marcati sono due fattori chiave. Per evitare rumori di misura dal carbonio non etichettati negli integratori di nutrienti, Un terreno minimo con una unica fonte di carbonio è necessario. Inoltre, la scelta di un substrato marcato è basato su come effettivamente sarà chiarire la via oggetto di analisi. Perché nuovi enzimi spesso coinvolgono diversi stereochimica di reazione o prodotti intermedi, in generale, substrati di carbonio singolarmente etichettati sono più informativi per la rilevazione di nuovi percorsi, di quelli etichettati in modo uniforme per la rilevazione di nuovi percorsi, ^{3, 4.} In secondo luogo, analizziamo amino acido utilizzando schemi di etichettatura GC -MS. Gli aminoacidi sono abbondanti di proteine ​​e quindi può essere ottenuto da idrolisi di biomassa. Gli aminoacidi possono essere derivatizzati da N-(terz-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) prima della separazione GC. TBDMS derivatizzati amino acidi può essere frammentato dagli Stati membri e determinare la disposizione degli frammenti. Funzione della massa di carica (m / z) rapporto di aminoacidi frammentato e non frammentati, possiamo dedurre i modelli possibili etichetta dei metaboliti centrali che sonoprecursori degli aminoacidi. In terzo luogo, abbiamo traccia transizioni di carbonio 13C nei percorsi proposti e, sulla base dei dati isotopomero, confermare se queste vie sono attivi ^2. Misurazione di aminoacidi fornisce informazioni isotopica etichettatura circa otto metaboliti precursore fondamentale nel metabolismo centrale. Questi nodi chiave del metabolismo possono riflettere le funzioni associate di vie centrali.

¹³ C-assistita di analisi del metabolismo tramite proteinogenici aminoacidi può essere ampiamente usato per la caratterizzazione funzionale di mal caratterizzati metabolismo microbico ^1. In questo protocollo, useremo Cyanothece 51142 come il ceppo modello per dimostrare l'uso di substrati carbonica marcata per scoprire nuove funzioni enzimatiche.

Protocollo

1. Coltura cellulare (Figura 1)

1. Crescere le cellule in terreno minimo con oligoelementi, sali, vitamine e substrati di carbonio specificatamente etichettati che sono i migliori per via di indagini. Utilizzare contenitori agitazione o bioreattori per colture cellulari. Nutrienti organici, come ad esempio estratto di lievito, può interferire con la misura di etichettatura di aminoacidi e quindi non può essere presente nel terreno di coltura.
2. Monitorare la crescita delle cellule per la densità ottica della cultura alle lunghezze d'onda ottimali (ad esempio, OD ₇₃₀ per Cyanothece 51142) con uno spettrofotometro UV / Vis.
3. Le cellule possono essere coltivate prima in un mezzo non etichettati. Il centro-log cellule fase di crescita sono preferiti da utilizzare per l'inoculazione (3% (v / v) da rapporto di volume inoculazione) del mezzo etichettati. La cultura dovrebbe essere etichettati sotto-cultura (3% v / v rapporto inoculazione) sullo stesso supporto etichettati in modo da evitare l'introduzione della non-etichettati carbonio dal inoculo iniziale.

2. Amino acid estrazione

1. Harvest sub-colture di cellule (10 ml) al centro-log fase di crescita mediante centrifugazione (10 min 8000 × g).
2. Risospendere il pellet in 1,5 ml di HCl 6M e trasferirlo ad un vetro trasparente, con tappo a vite fiala GC. Cap le fiale e metterli in un forno a 100 ° C per 24 ore di idrolizzare le proteine ​​in amminoacidi biomassa. Idrolisi di pellet biomassa può produrre 16 dei 20 comuni amminoacidi (Figura 2) ^5. Cisteina e triptofano sono degradati, e glutammina e asparagina vengono convertiti in glutammato e aspartato, rispettivamente.
3. Centrifugare la soluzione di amminoacidi a 20.000 g per 5 minuti con 2 ml provette Eppendorf, e trasferire il surnatante alle nuove fiale GC. Questo passaggio rimuove le particelle solide nella soluzione idrolisi.
4. Rimuovere i coperchi fiala GC e asciugare i campioni completamente sotto un flusso di aria con un Thermo Scientific riattiva Vap evaporatore (nota: un liofilizzatore può essere utilizzato anche tcampioni o secco). Questo passo può essere fatto dall'oggi al domani.

3. Derivatizzazione amino acidi e GC-MS condizioni

Analisi di aminoacidi o di carica / altamente metaboliti polari via GC richiede che questi metaboliti essere derivatizzati, in modo che gli aminoacidi sono volatili e possono essere separati mediante gascromatografia ^2.

1. Sciogliere l'campioni essiccati con 150 ml di tetraidrofurano (THF) e 150 ml di N-(terz-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide reagente derivatizzazione.
2. Incubare tutti i campioni in un forno o un bagno d'acqua compresa tra 65 e 80 ° C per 1 ora. Vortice di tanto in tanto per assicurarsi che i metaboliti nel flacone sono dissolti.
3. Centrifugare i campioni a 20.000 × g per 10 minuti, quindi trasferire il surnatante alle nuove fiale GC. Il surnatante deve essere una soluzione chiara e giallognola. A causa della saturazione dei rivelatori, GC-MS precisione della misura può essere influenzata dal conce altantration di iniezione TBDMS derivatizzati amino acidi (questi campioni presenta spesso colore marrone scuro), quindi, dovremmo diluire i campioni con THF prima di GC-MS di misura ^6.
4. Analizzare i campioni da GC-MS (usare una divisione 01:05 o rapporto 1:10, volume di iniezione = 1 ml, trasporto di gas elio = 1,2 mL / min). Utilizzare il seguente programma di temperatura GC: tenere a 150 ° C per 2 minuti, aumentare a 3 ° C al minuto a 280 ° C, aumentare a 20 ° C al minuto a 300 ° C, e quindi tenere per 5 minuti. Termine solvente può essere impostato come ~ 5 minuti (per una colonna di 30 metro GC). La gamma della massa per caricare il rapporto (m / z) in MS può essere impostata tra 60 e 500.

4. GC-MS analisi dei dati

1. TBDMS misura derivatizzati aminoacidi può anche essere influenzata dalla discriminazione isotopica nella separazione GC. Isotopi luce muoversi leggermente più veloce di tirare isotopi nella colonna GC. Per ridurre il bias potenziale misura, possiamo media lo spettro di massa di tutta lapicco di acido gamma amino ⁶
2. Il GC e MS spettri di metaboliti TBDMS derivatizzati sono stati segnalati prima del ^7. Il tempo di ritenzione GC e l'unico m / z picchi per ogni amminoacido sono illustrati nella Figura 3.
3. Derivatizzazione degli aminoacidi o metaboliti centrale introduce una notevole quantità di isotopi naturalmente marcato, tra cui ¹³ C (1,13%), ¹⁸ O (0,20%), ²⁹ Si (4,70%), e ³⁰ Si (3,09%). Della misura del rumore da isotopi naturali nello spettro prime isotopomero di massa può essere corretta utilizzando il software pubblicato ^{5, 8.} I dati finali etichettatura isotopici sono segnalati come frazioni di massa, ad esempio, M _0, M _1, M _2, M ₃ e M ₄ (che rappresentano frammenti contenenti da zero a quattro atomi di carbonio ¹³ C etichettati).
4. Misurazione di aminoacidi in grado di fornire informazioni isotopica etichettatura circa otto metaboliti cruciale precursore: 2-oxo-glutarmangiavano, 3-P-glicerato, l'acetil-CoA, erythrose-4-P, ossaloacetato, fosfoenolpiruvato, piruvato e ribosio-5-P. Gli schemi di etichettatura di questi metaboliti possono essere usati per individuare alcuni percorsi metabolici centrale (Figura 2) ^9. Il risultato degli esperimenti di etichettatura può essere ulteriormente confermata con metodi biochimici (ad esempio, RT-PCR).

5. Percorso di analisi dei dati utilizzando l'etichetta di aminoacidi

Investigando solo pochi amino acidi chiave prodotto da ben progettato ¹³ C esperimenti tracciante, si può rivelare diversi percorsi unici o attività enzimatiche senza eseguire sofisticate ¹³ C-metabolica analisi del flusso di tutto il metabolismo centrale.

1. Entner-Doudoroff percorso: [1 - ¹³ C] glucosio può essere utilizzato come fonte di carbonio. Se il percorso è attivo, l'etichettatura serina sarà significativamente inferiore a quella di etichettatura alanina ^10.
2. Ramificato TCA ciclo: [1 - ¹³ C]piruvato può essere utilizzato come fonte di carbonio. Se il ciclo TCA è rotto, aspartato può essere etichettata da due atomi di carbonio, mentre il glutammato viene etichettato con un solo carbonio ^{11, 12.}
3. CO ₂ fissazione di Calvin-Benson-Bassham ciclo in un metabolismo mixotrophic: non etichettati CO ₂ ed etichettato substrati di carbonio sono entrambi utilizzati come fonti di carbonio. Se il ciclo di Calvin è funzionale, serina e istidina etichettatura sarà notevolmente diluita, rispetto ad altri aminoacidi. Tale metodo può determinare la relativa fissazione di CO ₂ quando le fonti di carbonio organico sono presenti in media ^13.
4. Ossidativo via dei pentoso fosfati: [1 - ¹³ C] glucosio può essere utilizzato come fonte di carbonio. Se il percorso è attivo, alanina non etichettati sarà> 50% ^12.
5. Anaplerotiche percorso (ad esempio, PEP + CO ₂ ossalacetato à): ¹³ CO ₂ e non etichettati carbonio substrati (per esempio, glicerolo o pyruvate) può essere utilizzato come fonte di carbonio. Se il percorso è attivo, l'etichettatura aspartato sarà notevolmente arricchito, rispetto al alanina e serina ^13.
6. Re-citrato sintasi: [1 - ¹³ C] piruvato può essere utilizzato come fonte di carbonio. Se l'enzima è attivo, il glutammato è etichettato in β-carbossi gruppo ^{3, 4.}
7. Percorso Citramalate: [1 - ¹³ C] piruvato, [2 - ¹³ C] glicerolo, o [1 - ¹³ C] acetato può essere utilizzato come fonte di carbonio. Se il percorso è attivo, gli importi etichettatura leucina e isoleucina sono identici ^14.
8. Serina-isocitrato ciclo liasi: [1 - ¹³ C] piruvato o [1 - ¹³ C] lattato può essere utilizzato come fonte di carbonio. Se il percorso è attivo, il carbonio terza posizione in serina saranno etichettate ^15.
9. Utilizzo di sostanze nutritive (ad esempio, amminoacidi esogeni): un terreno di coltura con substrati di carbonio completamente etichettati e non etichettati aminoacidipuò essere utilizzato. Se le cellule selettivamente utilizzare questi nutrienti integrato non etichettati, vedremo una significativa diluizione etichettatura di questi aminoacidi nella biomassa. Questo metodo può essere utilizzato per indagare quali supplementi nutrizionali sono preferiti dalla cella ^16.

6. Rappresentante Risultati

Studi recenti hanno ripreso la bioenergia interessi nell'utilizzo microrganismi fototrofi romanzo per la produzione di bioenergia e cattura di CO _2. Negli ultimi anni, un bel po '13C metabolismo analisi, tra cui all'avanguardia 13C-Metabolica Analisi Flux (13C-MAE), sono stati applicati per indagare il metabolismo centrale nei batteri fototrofi, perché la conoscenza biochimica delle vie metaboliche centrale non è ben fondata in questi organismi non-modello ^{10, 11, 17-20.} Qui, presentiamo un esempio della scoperta di un percorso isoleucina si alternano in Cyanothece 51.142 ^21. Cianoothece 51142 non contiene l'enzima (CE 4.3.1.19, treonina ammoniaca-liasi), che catalizza la trasformazione del treonina a 2-ketobutyrate nel percorso tipico sintesi isoleucina. Per risolvere il percorso isoleucina, si cresce Cyanothece 51142 (20 ml) in ASP2 medio ²² con 54 mM glicerolo (2-13C,> 98%). Cyanothece 51142 utilizza 2 ^° posto glicerolo etichettata come la principale fonte di carbonio. Osserviamo che treonina e alanina hanno una etichetta carbonio, mentre isoleucina è etichettato con tre atomi di carbonio. Pertanto, in sintesi Cyanothece 51142 non possono essere derivati ​​dal percorso treonina utilizzati dalla maggior parte degli organismi (Figura 4). D'altra parte, leucina e isoleucina hanno modelli identici etichettatura basato su frammento (M-15) ⁺ e frammento (M-159) ^+. Per esempio, i dati isotopomero da [M-15] ⁺ (contenente non frammentato aminoacidi) mostrano l'etichettatura identico per leucina (M0 = 0,01, M1 = 0,03, = 0,21 M2, M3 = 0.69) E isoleucina (M0 = 0,01, M1 = 0,03, = 0,24 M2, M3 = 0,67). Così leucina e isoleucina devono essere sintetizzata dai precursori stesso (cioè, piruvato e acetil-CoA). Questa osservazione è coerente con la transizione carbonica marcata nella via citramalate per la sintesi isoleucina. A conferma di questa via, si cerca il comune banca dati Genome Institute e trovare la presenza di un sintasi citramalate Cima (cce_0248) in Cyanothece.

Figura 1. Il ¹³ C-assistita fasi di analisi via.

Figura 2. Aminoacidi utilizzato per acquisire il modello di etichettatura dei loro precursori metabolici. ACoA, l'acetil-CoA, AKG, α-chetoglutarato; C5P, ribosio 5-fosfato, CIT, citrato; E4P, erythrose 4-fosfato; G6P, glucosio-6-fosfato; OAA, ossalacetato; PEP, fosfoenolpiruvato, PGA, 3-fosfoglicerato, PYR, piruvato.

Figura 3. Picchi GC di 16 aminoacidi. TBDMS acidi derivatizzati aminoacidi sono incrinate da MS in due frammenti: (M-57) ^+, che contiene l'acido intero aminoacidi, e (M-159) ^+, che manca il gruppo α carbossile l'aminoacido. Per leucina e isoleucina, la (M-57) + è stato sormontato da picchi di massa. Ti consigliamo di utilizzare frammento (M-15) + per analizzare l'etichettatura intero aminoacido. L'(f302) gruppo + viene rilevato nella maggior parte dei aminoacidi, che contiene solo il primo (α-carbossilico gruppo) e carboni secondo una dorsale di aminoacidi. Perché questo picco MS è spesso elevato rumore a segnale rapporti, (f302) ⁺ non è raccomandato per analizzare quantitativamente i flussi metabolici ^7.

IGURA 4 "/>
Figura 4. Etichettatura transizioni nei percorsi isoleucina in Cyanothece 51142 (modificato dal nostro precedente articolo) ^21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Questo protocollo è costituito da alimentare la cella con un substrato etichettati e misurare i modelli con conseguente etichettatura isotopica in aminoacidi via GC-MS. Dal momento che MS dati (m / z rapporti) fare solo l'importo complessivo di etichettatura di ioni MS, dobbiamo valutare le distribuzioni isotopomero di aminoacidi esaminando la m / z rapporti di entrambi non frammentato (M-57) ⁺ e frammentato aminoacidi (cioè, (M-159) ⁺ e (f302) ^+). Inoltre, siamo in grado di esegui...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
TBDMS	Sigma-Aldrich	19915	-
THF	Sigma-Aldrich	34865	-
Substrato di carbonio etichettati	Cambridge Isotope Laboratories	Dipendono dal requisito sperimentale	Sito web: http://www.isotope.com
Gascromatografo	Agilent Technologies	Hewlett-Packard, modello 7890A	-
GC colonne	J & W Scientific, Folsom, CA	DB5 (30m)	-
Spettrometro di massa	Agilent Technologies	5975C	-
Riattiva Vap Evaporator	Thermo Scientific	TS-18825	Per l'essiccazione dei campioni di amminoacidi