Confirmation des voies métaboliques et la découverte par 13 C-étiquetage des acides aminés protéinogènes

Résumé

¹³ C-marquage isotopique est une technique utile pour déterminer le métabolisme de la cellule centrale pour divers types de microorganismes. Après les cellules ont été cultivées sur un substrat spécifique marqué, GC-MS de mesure peut révéler des voies métaboliques fonctionnelles basées sur les modèles d'étiquetage unique dans protéinogènes acides aminés.

Résumé

Les microbes ont des voies métaboliques complexes qui peuvent être étudiés en utilisant des méthodes de biochimie et fonctionnelles en génomique. Une technique important d'examiner le métabolisme des cellules centrales et de découvrir de nouvelles enzymes est de ¹³ C-analyse assistée par le métabolisme 1. Cette technique est basée sur le marquage isotopique, par lequel les microbes sont nourris avec un substrats C ¹³ étiquetés. En retraçant les chemins de transition entre les atomes de métabolites dans le réseau biochimique, nous pouvons déterminer les voies fonctionnelles et découvrir de nouvelles enzymes.

Comme une méthode complémentaire à la transcriptomique et la protéomique, les approches de isotopomère analyse assistée par des voies métaboliques contiennent trois grandes étapes ^2. Tout d'abord, nous faisons pousser des cellules avec des substrats étiquetés C ^13. Dans cette étape, la composition du milieu et la sélection des substrats marqués sont deux facteurs clés. Pour éviter les bruits de mesure à partir de carbone non-étiquetées dans les suppléments nutritifs, Un milieu minimal avec une seule source de carbone est nécessaire. En outre, le choix d'un substrat marqué est basé sur l'efficacité avec laquelle il élucider la voie en cours d'analyse. Parce que de nouvelles enzymes impliquent souvent la stéréochimie réaction différente ou des produits intermédiaires, en général, substrats carbonés individuellement étiquetés sont plus informatifs pour la détection de nouvelles voies que celles marqué uniformément pour la détection de ^trois nouvelles ^{voies, 4.} Deuxièmement, nous analysons les modèles d'étiquetage aminés acides par GC -SM. Les acides aminés sont abondants dans les protéines et peuvent ainsi être obtenus par hydrolyse de la biomasse. Les acides aminés peuvent être dérivés par la N-(tert-butyldiméthylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) avant la séparation GC. TBDMS dérivés des acides aminés peuvent être fragmentés par MS et aboutir à des tableaux différents de fragments. Basé sur la masse à charge (m / z) Le ratio des fragmentée et non fragmentés d'acides aminés, on peut en déduire les motifs possibles de l'étiquette centrale métabolites qui sontprécurseurs des acides aminés. Troisièmement, nous traçons les transitions de carbone 13C dans les voies proposées et, sur la base de données isotopomère, confirmer si ces voies sont ^deux actifs. Mesure des acides aminés fournit des informations de marquage isotopique environ huit métabolites précurseur crucial dans le métabolisme central. Ces nœuds métaboliques clés peuvent refléter les fonctions des associés voies centrales.

¹³ Analyse du métabolisme C-assistés par l'intermédiaire protéinogènes acides aminés peuvent être largement utilisés pour la caractérisation fonctionnelle du métabolisme microbien mal caractérisé ^1. Dans ce protocole, nous allons utiliser Cyanothece 51142 que la souche modèle pour démontrer l'utilisation de substrats de carbone marqué pour la découverte de nouvelles fonctions enzymatiques.

Protocole

1. La culture cellulaire (figure 1)

1. Cultiver des cellules dans un milieu minimal avec des oligo-éléments, sels, vitamines, et les substrats de carbone spécifiquement étiquetés qui sont les meilleurs pour enquête voie. Utilisez soit des flacons secouant ou bioréacteurs pour la culture cellulaire. Nutriments organiques, tels que l'extrait de levure, peuvent interférer avec la mesure de l'étiquetage des acides aminés et ne peuvent donc pas être présents dans le milieu de culture.
2. Surveiller la croissance cellulaire par la densité optique de la culture à une longueur d'onde optimale (par exemple, OD ₇₃₀ pour Cyanothece 51142) avec un spectrophotomètre UV / VIS.
3. Les cellules peuvent d'abord être cultivées dans un milieu non-étiquetés. Les cellules du Moyen-log phase de croissance sont à utiliser de préférence pour l'inoculation (3% (v / v) par rapport inoculation volume) de la moyenne étiquetés. La culture doit être étiqueté sous-cultivé (3% Ratio d'inoculation v / v) dans le même milieu étiquetés pour éviter l'introduction de la non-étiquetés de carbone de l'inoculum initial.

2. L'extraction des acides aminés

1. Récolte des sous-cultures de cellules (10 mL) en phase de croissance moyenne log par centrifugation (10 min, 8000 xg).
2. Reprendre le culot dans 1,5 ml de HCl 6M et le transférer sur un verre clair, vis-dessus du flacon GC. Cap les flacons et les placer dans un four à 100 ° C pendant 24 heures pour hydrolyser les protéines en acides aminés de la biomasse. L'hydrolyse de la biomasse granulés peuvent produire 16 des 20 acides aminés communs (figure 2) ^5. La cystéine et le tryptophane sont dégradées, et la glutamine et l'asparagine sont convertis au glutamate et d'aspartate, respectivement.
3. Centrifuger la solution d'acide aminé à 20 000 × g pendant 5 min à l'aide de 2 ml tubes Eppendorf, et de transférer les surnageants de nouveaux flacons GC. Cette étape élimine les particules solides dans la solution d'hydrolyse.
4. Retirez le couvercle flacon GC et sécher les échantillons complètement sous un courant d'air en utilisant un Thermo Scientific Reacti-Vap évaporateur (note: un lyophilisateur peut également être utilisé to échantillons secs). Cette étape peut être fait durant la nuit.

3. Dérivatisation des acides aminés et GC-MS des conditions

L'analyse des acides aminés ou chargé / hautement métabolites polaires par CG exige que ces métabolites être dérivé, de sorte que les acides aminés sont volatils et peuvent être séparés par chromatographie en phase gazeuse ^2.

1. Dissoudre les échantillons séchés avec 150 pi de tétrahydrofuranne (THF) et 150 pi de N-(tert-butyldiméthylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide réactif de dérivatisation.
2. Incuber tous les échantillons dans un four ou un bain d'eau entre 65 et 80 ° C pendant 1 heure. Vortex occasionnellement pour s'assurer les métabolites dans le flacon sont dissous.
3. Centrifuger les échantillons à 20 000 × g pendant 10 min, puis transférer le surnageant dans de nouveaux flacons GC. Le surnageant doit être une solution claire et jaunâtre. En raison de la saturation des détecteurs, la précision de mesure GC-MS peut être affectée par la haute concentration d'injecter TBDMS dérivés des acides aminés (ces échantillons montre souvent de couleur brun foncé), par conséquent, nous devrions diluer ces échantillons en utilisant du THF avant la GC-MS de mesure ^6.
4. Analyser les échantillons par GC-MS (utiliser une division de 1:5 ou de 1:10 injection de volume, 1 = pl, gaz vecteur hélium = 1,2 mL / min). Utilisez le programme de température suivant GC: maintenir à 150 ° C pendant 2 minutes, d'augmenter de 3 ° C par minute à 280 ° C, augmenter à 20 ° C par minute à 300 ° C, puis maintenez pendant 5 minutes. Délai solvant peut être défini comme ~ 5 min (pour une colonne de 30 mètres de GC). La gamme de rapport masse sur charge (m / z) dans la SEP peut être réglée entre 60 et 500.

4. GC-MS analyse des données

1. TBDMS de mesure dérivés d'acides aminés peuvent également être touchés par la discrimination isotopique dans la séparation GC. Isotopes légers déplacer légèrement plus rapide que soulèvent les isotopes dans la colonne GC. Afin de réduire les biais de mesure potentiel, nous pouvons en moyenne le spectre de masse de l'ensembleaminés large pic de l'acide ⁶
2. Le GC et MS spectres de métabolites dérivés TBDMS ont été signalés avant le ^7. Le temps de rétention GC et l'unique m / z des pics pour chaque acide aminé sont illustrés dans la Figure 3.
3. Dérivatisation des acides aminés ou des métabolites centrale introduit d'importantes quantités d'isotopes naturels étiquetés, y compris ¹³ C (1,13%), ¹⁸ O (0,20%), ²⁹ Si (4,70%), et ³⁰ Si (3,09%). Le bruit de mesure des isotopes naturels dans le spectre de masse isotopomère premières peut être corrigé en utilisant le logiciel publié ^{5, 8.} Les données finales de marquage isotopique sont déclarés en fractions de masse, par exemple, M _0, M _1, M _2, M ₃ et M ₄ (représentant des fragments contenant zéro à quatre carbones ¹³ C étiquetés).
4. Mesure des acides aminés peut fournir des informations de marquage isotopique environ huit métabolites précurseur cruciale: 2-oxo-glutarmangé, 3-P-glycérate, l'acétyl-CoA, érythrose-4-P, l'oxaloacétate, phosphoénolpyruvate, du pyruvate et le ribose-5-P. Les schémas d'étiquetage de ces métabolites peuvent être utilisées pour identifier plusieurs voies métaboliques centrales (figure 2) ^9. Le résultat des expériences d'étiquetage peut être confirmée en utilisant des méthodes de biochimie d'autres (par exemple, la RT-PCR).

5. L'analyse des voies à l'aide de données étiquetées acide aminé

En examinant seulement quelques acides aminés clés produite à partir de ¹³ bien conçu expériences de traçage C, nous pouvons révéler plusieurs voies uniques ou des activités enzymatiques sans effectuer une analyse du flux sophistiqués ¹³ C-métabolique du métabolisme central entier.

1. Entner-Doudoroff voie: [1 - ¹³ C] glucose peut être utilisé comme source de carbone. Si la voie est active, l'étiquetage sérine sera sensiblement inférieur à l'étiquetage de l'alanine ^10.
2. Ramifiée cycle de Krebs: [1 - ¹³ C]pyruvate peut être utilisé comme source de carbone. Si le cycle de Krebs est cassé, l'aspartate peut être marqué par deux carbones, tandis que le glutamate est étiqueté avec un seul carbone ^{11, 12.}
3. _Fixation du CO2 par Calvin-Benson-Bassham cycle dans un métabolisme mixotrophes: non étiquetés CO ₂ et substrats marqués au carbone sont tous deux utilisés comme sources de carbone. Si le cycle de Calvin est fonctionnel, la sérine et l'histidine étiquetage sera considérablement diluée, comparé à d'autres acides aminés. Une telle méthode permet de déterminer le CO ₂ relativement fixation lorsque les sources de carbone organique sont présents dans les ¹³ moyennes.
4. Oxydatif voie des pentoses phosphates: [1 - ¹³ C] glucose peut être utilisé comme source de carbone. Si la voie est active, l'alanine non étiqueté sera> 50% ^12.
5. Anaplerotic voie (par exemple, le PEP + CO oxaloacétate A _2): ¹³ CO ₂ et non étiquetés de carbone substrats (par exemple, la glycérine, pyruvate) peut être utilisé comme source de carbone. Si la voie est active, l'étiquetage aspartate sera considérablement enrichi, en comparant à l'alanine et la sérine ^13.
6. Re citrate synthase: [1 - ¹³ C] pyruvate peut être utilisé comme source de carbone. Si l'enzyme est active, le glutamate est étiqueté en β-carboxyle du groupe ^{3, 4.}
7. Voie Citramalate: [1 - ¹³ C] pyruvate [2 - ¹³ C] glycérol, ou [1 - ¹³ C] acétate peut être utilisé comme source de carbone. Si la voie est active, les montants étiquetage leucine et l'isoleucine sont identiques ^14.
8. Serine-isocitrate lyase cycle de: [1 - ¹³ C] pyruvate ou [1 - ¹³ C] lactate peut être utilisé comme source de carbone. Si la voie est active, le carbone troisième position dans la sérine seront étiquetés ^15.
9. L'utilisation des nutriments (par exemple, acides aminés exogènes): un milieu de culture avec des substrats carbonés dûment étiquetés et non étiquetés acides aminéspeuvent être utilisés. Si les cellules de manière sélective utilisent ces nutriments complétées non étiquetés, nous allons voir une dilution significative étiquetage de ces acides aminés dans la biomasse. Cette méthode peut être utilisée pour étudier ce qui suppléments nutritifs sont préférés par la cellule ^16.

6. Les résultats représentatifs

Des études récentes ont relancé la bioénergie intérêt dans l'utilisation de microorganismes phototrophes roman pour la production de bioénergie et de captage du CO _2. Dans les dernières années, un assez grand nombre 13C-métabolisme des analyses, y compris les analyses avancées de flux métaboliques 13C (13C-AMF), ont été appliquées pour enquêter sur les métabolismes central dans les bactéries phototrophes, car la connaissance biochimique des voies métaboliques central n'est pas bien fondée dans ces organismes non-modèles ^{10, 11, 17-20.} Ici, nous présentons un exemple de la découverte d'une voie de remplacement dans l'isoleucine Cyanothece 51142 ^21. Cyanothece 51142 ne contient pas les enzymes (EC 4.3.1.19, la thréonine ammonia-lyase), qui catalyse la conversion de la thréonine à 2-cétobutyrate dans la voie de synthèse de l'isoleucine typique. Pour résoudre la voie isoleucine, nous grandissons Cyanothece 51142 (20 ml) en moyenne ²² ASP2 avec 54 mM de glycérol (2-13C,> 98%). Cyanothece 51142 utilise 2 ^e position du glycérol étiquetés comme source de carbone principale. Nous observons que la thréonine et alanine ont une étiquette carbone, tandis que l'isoleucine est étiqueté avec trois carbones. Par conséquent, la synthèse dans Cyanothece 51142 ne peut pas être dérivée de la route thréonine employé par la plupart des organismes (figure 4). D'autre part, la leucine et l'isoleucine ont des modes d'étiquetage identique, basé sur des fragments (M-15) ⁺ et de fragment (M-159) ^+. Par exemple, les données isotopomère de [M-15] ⁺ (contenant des acides aminés non fragmentés) montrent étiquetage identique pour la leucine (M0 = 0,01, M1 = 0,03, = 0,21 M2, M3 = 00,69) et l'isoleucine (M0 = 0,01, M1 = 0,03, = 0,24 M2, M3 = 0,67). Ainsi leucine et l'isoleucine doivent être synthétisés à partir des mêmes précurseurs (à savoir, le pyruvate et l'acétyl-CoA). Cette observation est cohérente avec la transition de carbone marqué dans la voie de synthèse citramalate isoleucine. Pour confirmer cette voie, on recherche le génome commun de bases de données Institut et de trouver la présence d'une synthase citramalate Cima (cce_0248) dans Cyanothece.

Figure 1. Le ¹³ C-assistés étapes analyse des voies.

Figure 2. Les acides aminés utilisés pour acquérir le modèle d'étiquetage de leurs précurseurs métaboliques. L'APECA, l'acétyl-CoA; AKG, α-cétoglutarate; C5P, le ribose 5-phosphate; CIT, le citrate; E4P, érythrose 4-phosphate; G6P, glucose-6-phosphate; OAA, oxaloacétate; PEP, phosphoénolpyruvate; PGA, la 3-phosphoglycérate; PYR, pyruvate.

Figure 3. Pics CG pour 16 acides aminés. TBDMS dérivés des acides aminés sont fissurés par MS en deux fragments: (M-57) ^+, contenant l'acide aminé ensemble, et (M-159) ^+, ce qui manque au groupe α carboxyle de l'acide aminé. Pour la leucine et l'isoleucine, la + (M-57) a été recouverte par d'autres pics de masse. Nous vous suggérons d'utiliser fragment (M-15) + d'analyser le marquage des acides aminés ensemble. Le groupe (F302) + est détecté dans la plupart des acides aminés, qui ne contient que le premier (α-carboxyle du groupe) et les carbones secondes dans une épine dorsale d'acide aminé. Parce que ce pic MS a souvent élevé de bruit-signal ratios (F302) ⁺ n'est pas recommandé pour l'analyse quantitative des flux métaboliques ^7.

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Figure 4. Étiquetage des transitions dans les voies de l'isoleucine en Cyanothece 51142 (modifié d'après notre précédent article) ^21.

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Discussion

Ce protocole consiste à alimenter la cellule avec un substrat marqué et mesurer les tendances résultant de marquage isotopique dans les acides aminés via la GC-MS. Depuis de données MS (m / z ratios) donner juste la quantité globale de l'étiquetage des ions MS, nous avons à évaluer les distributions isotopomère d'acides aminés en examinant les rapports m / z de deux non fragmentés (M-57) ⁺ et fragmenté des acides aminés (ie, (M-159) ⁺ et (F302) ^+). Par ailleurs, nou...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
TBDMS	Sigma-Aldrich	19915	-
THF	Sigma-Aldrich	34865	-
Substrat de carbone marqué	Cambridge Isotope Laboratories	Dépendent de l'exigence expérimentale	Site Web: http://www.isotope.com
Chromatographe en phase gazeuse	Agilent Technologies	Hewlett-Packard, modèle 7890A	-
Colonnes GC	J & W Scientific, Folsom, CA	DB5 (30m)	-
Spectromètre de masse	Agilent Technologies	5975C	-
Reacti-Vap EvaporAtor	Thermo Scientific	TS-18825	Pour le séchage des échantillons d'acides aminés