Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13 C-etiketleme

Özet

¹³ C-izotop etiketleme çeşitli türleri için mikroorganizmaların hücre merkezi metabolizma belirlenmesi için yararlı bir tekniktir. Hücreleri belirli bir substrat ile etiketli kültüre edildikten sonra, GC-MS ölçüm aminoasittir benzersiz etiketleme desen dayalı işlevsel metabolik yollar ortaya çıkarabilir.

Özet

Mikroplar, biyokimya ve işlevsel genomik yöntemleri kullanılarak araştırılmalıdır karmaşık metabolik yollar var. Hücre merkezi metabolizma incelemek ve yeni enzimler keşfetmek için önemli bir ^{teknik, 13} C-destekli metabolizma analizi 1 . Bu teknik izotopik etiketleme, mikropların ¹³ C etiketli substratları ile beslenen sayede dayanmaktadır. Biyokimyasal ağ metabolitleri arasında atom geçiş yolları takip ederek, işlevsel yollar belirlemek ve yeni enzimler keşfetmek.

Transkriptomik ve proteomik, metabolik yollarının isotopomer yardımlı analizi için tamamlayıcı bir yöntem yaklaşımları üç önemli adımlar ² içeren İlk ¹³ C etiketli substratlar hücreleri büyür. Bu adımda, orta ve etiketli yüzeylerin seçimi kompozisyon iki önemli faktör vardır. Besin takviyeleri etiketli karbon ölçümü gürültüleri önlemek için, Tek bir karbon kaynağı ile en az bir ortam gereklidir. Ayrıca, etiketli bir substrat seçim analiz edilen yolun açıklamak ne kadar etkili dayanmaktadır. Roman enzimler genellikle farklı reaksiyon stereokimya genel veya ara ürünler, içerdiğinden, tek başına etiketli karbon yüzeyler, roman ^{yollar 3,} 4 tespiti için düzgün etiketli olanlardan daha roman yollarının tespiti için daha bilgilendirici İkincisi, biz GC kullanarak amino asit etiketleme kalıplarını analiz -MS. Amino asitler protein bol miktarda bulunmaktadır ve dolayısıyla, biyokütle hidroliz elde edilebilir. Amino asitler, GC ayırma önce N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) derivatized olabilir. TBDMS derivatized amino asitler, MS ve parçaları farklı diziler sonucu parçalanmış olabilir. Parçalanmış ve parçalanmamış amino asitler (m / z) oranı sorumlu kitle dayanarak, merkezi metabolitlerin mümkün etiketli desen anlayamayacağımızamino asitlerin öncüleri Üçüncü olarak, biz bu yolları ² aktif olup olmadığını onaylamak, isotopomer verilere göre, önerilen yollar 13C karbon geçişleri izlemek ve. Amino asit ölçümü izotopik etiketleme merkezi metabolizma sekiz önemli habercisi metabolitleri hakkında bilgi sağlar. Bu metabolik anahtar düğümler ilişkili merkezi yollarının fonksiyonlarını yansıtır.

Aminoasittir ile ¹³ C-destekli metabolizma analizi kötü karakterize mikrobiyal metabolizma ¹ fonksiyonel karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılır . Bu protokol, yeni enzimatik fonksiyonları keşfetmek için etiketli karbon substratların kullanımını göstermek için model suşu olarak Cyanothece 51.142 kullanacaktır.

Protokol

1. Hücre kültürü (Şekil 1)

1. Iz elementler, tuzlar, vitaminler ve yolağı soruşturma için en iyi olan, özellikle etiketli karbon substratları ile en az orta hücreleri büyütün. Hücre kültürü için sallayarak matara veya biyoreaktörler ya kullanın. Organik besinler, maya özü gibi, amino asit etiketleme ölçümü ile engel olabilir ve bu nedenle kültür ortamı mevcut olamaz.
2. UV / VIS spektrofotometre ile optimal bir dalga boyu (örneğin, Cyanothece 51.142 _{OD 730)} kültür optik yoğunluk hücre büyümesini izleyin .
3. Hücreler ilk etiketli olmayan bir ortamda yetiştirilebilir. Orta-log büyüme aşamasında hücreleri etiketli orta aşılama (hacim aşılama oranı% 3 (v / v)) için kullanılacak tercih edilir. Etiketli ilk inokulum olmayan etiketli karbon giriş önlemek için etiketli aynı ortamda kültür (% 3 v / v aşılama oranı) alt kültür olmalıdır.

2. Amino asit ekstraksiyon

1. Santrifüj (10 dakika, 8000 × g) ile orta-log büyüme aşamasında Hasat alt-kültür hücreleri (10 ml).
2. 6M HCl 1.5mL içinde pelletini tekrar ve net bir cam, vida-üst GC flakon aktarmak. Şişeleri Cap ve biyokütle proteinler amino asitlere hidroliz 24 saat boyunca 100 ° C fırında koyun. Biyokütle pelet Hidroliz 20 ortak amino asitler (Şekil 2) ⁵ 16 verim alınabilir. Sistein ve triptofan bozulmuş, glutamin ve asparajin sırasıyla, glutamat ve aspartat dönüştürülür.
3. 2 ml Eppendorf tüpler kullanılarak 5 dakika 20.000 amino asit çözeltisi × g Santrifüj, ve yeni bir GC şişeleri süpernatantlar aktarmak. Bu adım, hidroliz çözüm katı partikülleri.
4. GC flakon kapaklarını çıkarın ve örnekleri Thermo Scientific Reacti Vap evaporatör (not kullanarak hava akımı altında tamamen kuru bir dondurarak kurutma makinesi de kullanılabilir.o kuru örnekler). Bu adım, bir gecede yapılabilir.

3. Amino asit türevlendirme ve GC-MS koşulları

GC ile amino asitler ya da yüksek ücret / polar metabolitler analizi, bu metabolitlerin amino asitler, uçucu ve ^{gaz kromatografisi} 2 ile ayrılabilir, böylece derivatized olmasını gerektirir.

1. 150 mcL tetrahidrofuran (THF) ve N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide türevlendirme reaktifi 150 mcL ile kurutulmuş örnekleri çözülür.
2. Tüm örnekler, 65 ve 80 ° C 'de 1 saat süreyle arasında bir fırın veya bir su banyosunda inkübe edin. Flakonda metabolitleri çözülür emin olmak için ara sıra karıştırın.
3. 10 dakika 20.000 × g örnekleri santrifüj, ve ardından yeni bir GC şişeleri supernatant aktarmak. Süpernatant berrak ve sarımsı bir çözüm olmalıdır. Dedektörleri doygunluk nedeniyle, GC-MS ölçüm hassasiyeti yüksek conce etkilenebilirntration enjekte TBDMS derivatized amino asitler (bu örnekler çoğu zaman koyu kahverengi renk gösterir), bu nedenle, biz bu örneklerin, GC-MS ^ölçüm 6 önce THF kullanılarak seyreltik olmalıdır .
4. GC-MS (1:05 ​​ya da 1:10 split oranı, enjeksiyon hacmi = 1 mcL, taşıyıcı gaz helyum = 1.2 ml / dak). Numunelerin analiz Aşağıdaki GC sıcaklık programı kullanın: tutun 150 ° C, 2 dakika boyunca 3 artış ° C dakikada 280 ° C, 20 artış ° C dakikada 300 ° C ve daha sonra 5 dakika boyunca tutun. Solvent gecikme ~ 5 dakika (30 metre GC sütun için) olarak ayarlanabilir. MS oranı (m / z) şarj etmek için kitle aralığı 60 ve 500 arasında ayarlanabilir.

4. GC-MS veri analizi

1. GC ayrılık izotop ayrımcılıktan TBDMS derivatized amino asit ölçümü de etkilenebilir. Işık izotoplar GC sütunundaki izotoplar kabarması daha hızlı hafifçe hareket. Potansiyel ölçüm önyargı azaltmak için, biz bütün tayf ortalamaamino asit pik ⁶
2. TBDMS derivatized metabolitleri GC ve MS spektrumları ⁷ önce bildirilmiştir. Her amino asit için GC saklama süresi ve eşsiz m / z doruklarına Şekil 3'te gösterilmiştir.
3. Amino asitler ya da merkez metabolitleri Türevlendirme ¹³ C (1.13%) de dahil olmak üzere önemli miktarda doğal ^etiketli izotoplar, 18 O (% ^0,20), 29 Si ^(4.70%), ve 30 Si (3.09% ) tanıtır. Ham kitle isotopomer spektrumda doğal izotopları ölçüm gürültü yayınlanan yazılım ^{5, 8} kullanarak düzeltilebilir. Son izotopik etiketleme verileri kitle kesirler, örneğin, M _0, M _1, M _2, M ₃ ve M ₄ olarak bildirilmiştir (sıfır ile dört ¹³ C etiketli karbonlar içeren parçaları temsil eder).
4. 2-oxo-glutar: amino asit ölçümü sekiz önemli habercisi metabolitleri hakkında izotopik etiketleme bilgi sağlayabilir3-P-glycerate, asetil-KoA, erythrose-4-P, oksaloasetat, fosfoenolpiruvat, piruvat ve riboz-5-P, yedik. Bu metabolitlerin etiketleme desen birçok merkez metabolik yollar (Şekil 2) ⁹ tanımlamak için kullanılır. Etiketleme deneyler sonucu diğer biyokimya yöntemlerini kullanarak (örneğin, RT-PCR) teyit edilebilir.

5. Etiketli amino asit verileri kullanarak Pathway analizi

Iyi tasarlanmış ¹³ C tracer deneyler sadece bir kaç temel amino asitler araştıran, tüm merkezi metabolizma gelişmiş ¹³ C-metabolik akı analizi yapılmadan birçok benzersiz yollar veya enzim faaliyetlerini ortaya çıkarabilir.

1. Entner-Doudoroff yolu: [1 - ¹³ C] glukoz karbon kaynağı olarak kullanılabilir. Yolun etkinse, serin etiketleme, ^alanin 10 etiketleme anlamlı olarak daha düşük olacaktır .
2. Dallı TCA döngüsü: [1 - ¹³ C]pirüvat karbon kaynağı olarak kullanılabilir. TCA döngüsü kırık ise sadece bir karbon ^{11, 12} glutamat ile etiketlenmiş ise, aspartat iki karbonlar etiketli olabilir.
3. Mixotrophic metabolizmasında Calvin-Benson-Bassham döngüsü ile CO ₂ fiksasyonu: CO ₂ Sigara etiketli ve karbon substratlar etiketli karbon kaynağı olarak kullanılır. Calvin döngüsü fonksiyonel ise, serin ve histidin etiketleme diğer amino asitler ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde, seyreltilmiş olacaktır. Bu yöntem orta ¹³ organik karbon kaynakları mevcut olduğunda göreli CO ₂ fiksasyonu belirleyebilirsiniz.
4. Oksidatif pentoz fosfat: [1 - ¹³ C] glikoz, karbon kaynağı olarak kullanılabilir . Yolun etkinse, etiketli alanin> 50% ¹² olacaktır.
5. Anaplerotic yolağı (örneğin, KEP + CO ₂ à oksaloasetat): ¹³ CO ₂ ve olmayan etiketli karbon yüzeylerde (örneğin, gliserin veya piruvate) karbon kaynağı olarak kullanılabilir. Yolun etkinse, aspartat etiketleme, ¹³ serin alanin ve karşılaştırarak önemli ölçüde zenginleştirilmiş olacak.
6. Re-sitrat sentaz: [1 - ¹³ C] pirüvat karbon kaynağı olarak kullanılabilir. Enzim aktif ise β-karboksil grubu ^{3, 4,} glutamat etiketlenmiştir.
7. Citramalate yolu: [1 - ¹³ C] piruvat, [2 - ¹³ C] gliserol, ya da [1 ^- 13 C] asetat, karbon kaynağı olarak kullanılabilir. Yolun etkinse, lösin ve izolösin etiketleme tutarları ¹⁴ aynıdır.
8. Serine isocitrate liaz döngüsü: [1 - ¹³ C] pirüvat veya [1 - ¹³ C] laktat karbon kaynağı olarak kullanılabilir. Yolun etkinse, serin üçüncü konuma karbon ¹⁵ etiketli olacaktır.
9. Besin kullanımı (örneğin, eksojen amino asitler): tam etiketli karbon yüzeyleri ve etiketli olmayan amino asitler ile bir kültür ortamıkullanılabilir. Hücrelerin bu takviye etiketli olmayan besinleri seçerek kullanır, biz biyokütle bu amino asitlerin önemli bir etiketleme seyreltme göreceksiniz. Bu yöntem, hangi besin takviyeleri ¹⁶ hücre tarafından tercih edilmektedir araştırmak için kullanılabilir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Son biyoenerji çalışmaları, biyoenerji üretimi için yeni fototrofik mikroorganizmalar kullanılarak ilgi yeniden canlandı _ve 2 yakalama CO . Geçmiş yıllarda, biyokimyasal bilgi merkezi metabolik yollar iyi değil, çünkü oldukça gelişmiş 13C-Metabolik Akı Analizler (13C-MFA) dahil olmak üzere birkaç 13C-metabolizma analizleri, merkezi metabolizmaları fototrofik bakteri araştırmak için uygulanan edilmiştir olmayan bu model organizmaların ^{10, 11, 17-20.} Burada, biz, Cyanothece, alternatif bir izolösin yolun ^keşif 51.142 21 bir örnek sunuyoruz . Camgöbeğiothece 51.142 tipik izolösin sentez yolu 2-ketobutyrate treonin dönüşüm katalize enzimi (EC 4.3.1.19, treonin amonyak liaz) içermez. Izolösin yol gidermek için, 54 mM gliserol (2-13C,>% 98) Cyanothece 51.142 ASP2 orta ²² (20 ml) büyür. Cyanothece 51.142 ana karbon kaynağı olarak etiketlenmiş gliserol ^2. konumunu kullanır. Izolösin üç karbonlar ile etiketlenmiş ise treonin ve alanin bir karbon etiketli olduğunu gözlemliyoruz. Bu nedenle, çoğu organizmalar (Şekil 4) tarafından istihdam treonin güzergahtan Cyanothece 51.142 sentezi elde edilebilir. Öte yandan, lösin ve izolösin, belgeye dayanan aynı etiketleme kalıpları ^(M-15) ve parça ^(M-159) . Örneğin, M-15 isotopomer veri [] ⁺ (parçalanmamış amino asitleri içeren), lösin için aynı etiketleme (M0 = 0.01 = 0.21 M1 = 0.03, M2, M3 = 0.69) Ve izolösin (M0 = 0.01, M1 = 0.03, M2 = 0.24, M3 = 0,67). Böylece lösin ve izolösin aynı öncüleri (yani, piruvat ve asetil-CoA) sentezlenen olmalıdır. Bu gözlem, izolösin sentezi için citramalate yol etiketli karbon geçiş ile tutarlıdır. Bu yolun onaylamak için, Joint Genom Enstitüsü veritabanında arama ve Cyanothece citramalate sentaz Cima (cce_0248) varlığı bulmak.

Şekil ^{1: 13} C-destekli yolak analizi adımları .

Şekil 2 metabolik öncüleri etiketleme desen elde etmek için kullanılan Amino asitler. ACoA, asetil-CoA; AKG, α-Ketoglutarate; C5P, riboz 5-fosfat; CIT, sitrat; E4P, erythrose 4-fosfat; G6P, glukoz 6-fosfat; OAA oksaloasetat; KEP fosfoenolpiruvat; PGA, 3-fosfogliserat; PYR, piruvat.

Şekil 3. 16 amino asitler için GC zirveleri. MS TBDMS derivatized amino asitler iki parça halinde kırık: (E-57) ^+, tüm amino asit içeren ve (M-159) ^+, α amino asidin karboksil grubu yoksun. Lösin ve izolösin için (E-57) + diğer kitle zirveleri ile çakışmış oldu. Biz tüm amino asit etiketleme analiz parçası (E-15) + kullanmanızı öneririz. (F302) + grup, bir amino asit omurga sadece ilk (α-karboksil grubu) ve ikinci karbonlar içeren, en çok amino asit tespit edilmiştir. Bu MS tepe sık sık yüksek gürültü-sinyal oranları olduğundan, (F302) ⁺ metabolik akıları ⁷ kantitatif analiz için tavsiye değildir.

igure 4 "/>
Şekil 4 Cyanothece 51.142 (önceki kağıt değiştirilmiş) ²¹ izolösin yollar geçişler Etiketleme.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol etiketli substrat hücre GC-MS ile amino asitler beslenme ve elde edilen izotopik etiketleme desen ölçme oluşmaktadır. MS veri (m / z oranlarına) MS iyonlarının etiketleme sadece toplam miktar vermek zamandan beri, biz inceleyerek hem de parçalanmamış (E-57) ⁺ m / z oranları ve parçalanmış amino asitler, amino asitlerin isotopomer dağılımları değerlendirmek için (yani, (M-159) ⁺ (F302) ^+). Ayrıca, kimyasal olarak benzer bir ortamı ancak farklı etiketlem...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
TBDMS	Sigma-Aldrich	19915	-
THF	Sigma-Aldrich	34865	-
Etiketli karbon substrat	Cambridge İzotop Laboratuvarlarında	Deneysel gereksinimi bağlıdır.	Web sitesi : http://www.isotope.com
Gaz kromatograf	Agilent Technologies	Hewlett-Packard, model 7890A	-
GC Kolonları	J & W Scientific, Folsom, CA	DB5 (30m)	-
Kütle spektrometresi	Agilent Technologies	5975C	-
Reacti-Vap Evaporator	Thermo Scientific	TS-18.825	Amino asit örnekleri kurutma için