Stoffwechselweg der Firmung und der Entdeckung durch 13 C-Kennzeichnung von proteinogenen Aminosäuren

Zusammenfassung

¹³ C-Isotopenmarkierung ist eine nützliche Technik für die Bestimmung der Zelle zentralen Stoffwechsel für verschiedene Arten von Mikroorganismen. Nachdem die Zellen mit einer bestimmten markiertem Substrat gezüchtet haben, können GC-MS-Messung zeigen funktionale Stoffwechselwege auf einzigartige Kennzeichnung Muster in proteinogenen Aminosäuren basiert.

Zusammenfassung

Mikroben haben komplexe Stoffwechselwege, untersucht mit Hilfe der Biochemie und der funktionellen Genomik Methoden werden kann. Eine wichtige Technik, um Zelle zentralen Stoffwechsel untersuchen und entdecken neue Enzyme ist ¹³ C-assisted Stoffwechsel-Analyse 1. Diese Technik basiert auf Isotopenmarkierung, wobei Mikroben mit ¹³ C markierten Substraten zugeführt beruhen. Die Verfolgung der Atom Übergang Wege zwischen Metaboliten in die biochemische Netzwerk können wir bestimmen, funktionale Wege und entdecken neue Enzyme.

Als ergänzende Methode zur Transkriptom-und Proteomforschung, Ansätze für Isotopomer-gestützte Analyse von Stoffwechselwegen drei große Schritte ² enthalten. Erstens, wir wachsen Zellen mit ¹³ C markierten Substraten. In diesem Schritt werden die Zusammensetzung des Mediums und die Auswahl der markierten Substraten zwei Schlüsselfaktoren. Um zu vermeiden, Mess-Geräusche aus nicht-markierten Kohlenstoffs in Nahrungsergänzungsmittel, Ist ein Minimal-Medium mit einer einzigen Kohlenstoffquelle erforderlich. Weiterhin ist die Wahl einer markierten Substrat, wie effektiv es wird der Weg zu analysierenden Aufklärung basiert. Da neuartige Enzyme beinhalten häufig unterschiedliche Reaktion Stereochemie oder Zwischenprodukte in der Regel einfach markierten Kohlenstoffsubstrate informativer für den Nachweis neuartiger Wege als einheitlich bezeichnet diejenigen für die Erkennung von neuen Bahnen ^{3, 4} sind. Zweitens analysieren wir Aminosäure Kennzeichnung Muster mit GC -MS. Aminosäuren sind reich an Protein und kann daher aus Biomasse Hydrolyse erhalten werden. Aminosäuren können durch N-(tert-Butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) derivatisiert vor GC-Trennung. TBDMS derivatisierten Aminosäuren kann durch MS und das Ergebnis in verschiedenen Arrays von Fragmenten fragmentiert. Bezogen auf die Masse zu Ladung (m / z)-Verhältnis von fragmentierten und unfragmentierte Aminosäuren, können wir ableiten, die möglichen beschriftet Muster der zentralen Metaboliten, dieVorläufer der Aminosäuren. Drittens verfolgen wir 13C Carbon-Übergänge in der vorgeschlagenen Wege und auf der Grundlage der Isotopomer Daten bestätigen, ob diese Wege ^Aktiv-2 sind. Messung von Aminosäuren bietet Isotopenmarkierung Informationen rund acht entscheidende Vorstufe Metaboliten in den zentralen Stoffwechsel. Diese metabolischen Schlüssel Knoten spiegeln die Funktionen der assoziierten mittel-Bahnen.

¹³ C-assisted Stoffwechsel-Analyse über proteinogenen Aminosäuren können sehr für die funktionelle Charakterisierung von schlecht charakterisiert mikrobiellen Stoffwechsel ¹ verwendet werden. In diesem Protokoll werden wir Cyanothece 51142 als Modell Belastung verwenden, um die Verwendung markierter Kohlenstoff-Substraten für die Entdeckung neuer enzymatischer Funktionen zu demonstrieren.

Protokoll

1. Zellkultur (Abbildung 1)

1. Wachsen Zellen in Minimalmedium mit Spurenelemente, Salze, Vitamine und spezifisch markierten Kohlenstoffsubstrate die am besten für Weges Untersuchung. Verwenden Sie entweder Schüttelkolben oder Bioreaktoren für die Zellkultur. Organische Nährstoffe, wie Hefeextrakt, kann mit der Messung von Aminosäure-Kennzeichnung beeinträchtigen und somit nicht anwesend sein kann in dem Kulturmedium.
2. Monitor Zellwachstum durch die optische Dichte der Kultur bei einer optimalen Wellenlänge (z. B. OD ₇₃₀ für Cyanothece 51142) mit einem UV / Vis-Spektralphotometer.
3. Die Zellen können zunächst in einem nicht-markierten Medium kultiviert werden. Die Mitte-log Wachstumsphase Zellen werden bevorzugt, um für die Impfung (3% (v / v) Vol. Impfung ratio) der markierten Medium verwendet werden. Die markierten Kultur sollte subkultiviert (3% v / v Impfung ratio) in der gleichen Bezeichnung Medium, um die Einführung von nicht-markierten Kohlenstoffs aus dem ersten Impfstoff zu vermeiden.

2. Aminosäure-Extraktion

1. Ernte-sub-kultivierten Zellen (10 mL) in der Mitte-log Wachstumsphase durch Zentrifugation (10 min, 8000 × g).
2. Das Pellet in 1,5 ml 6M HCl und überträgt es auf ein klares Glas, Schraubverschluss GC Fläschchen. Verschließen Sie die Fläschchen und legen Sie sie in einem 100 ° C im Ofen für 24 Stunden, um die Biomasse Proteine ​​in Aminosäuren hydrolysieren. Die Hydrolyse von Biomasse-Pellets können Ausbeute 16 der 20 Standard-Aminosäuren (Abbildung 2) ^5. Cystein und Tryptophan abgebaut werden, und Glutamin und Asparagin umgewandelt werden, um Glutamat und Aspartat, bzw..
3. Centrifuge die Aminosäure-Lösung bei 20.000 × g für 5 min mit 2 ml Eppendorf-Röhrchen, und übertragen Sie die Überstände an neue GC-Vials. Dieser Schritt entfernt festen Teilchen in der Hydrolyse-Lösung.
4. Entfernen Sie die GC-Vial Deckel und trocknen die Proben vollständig unter einem Luftstrom mit einer Thermo Scientific Reacti-Vap Verdampfer (Anmerkung: einen Gefriertrockner kann auch t verwendet werdeno trockene Proben). Dieser Schritt kann über Nacht geschehen.

3. Aminosäure Derivatisierung und GC-MS-Bedingungen

Die Analyse der Aminosäuren oder geladenen / polaren Metaboliten via GC setzt voraus, dass diese Metaboliten derivatisiert werden, so dass die Aminosäuren flüchtig sind und kann mittels Gaschromatographie ² getrennt werden.

1. Lösen Sie die getrockneten Proben mit 150 ul von Tetrahydrofuran (THF) und 150 ul N-(tert-Butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide Derivatisierungsreagenz.
2. Inkubieren Sie alle Proben in einem Ofen oder einem Wasserbad zwischen 65 und 80 ° C für 1 Stunde. Vortex gelegentlich um sicherzustellen, dass die Metaboliten in der Durchstechflasche gelöst sind.
3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 xg für 10 min und dann den Überstand in neue GC-Vials. Der Überstand sollte eine klare und gelbliche Lösung sein. Aufgrund der Sättigung der Detektoren kann GC-MS Messgenauigkeit durch die hohe conce betroffen seinntration der injizierten TBDMS derivatisierten Aminosäuren (diese Proben zeigt oft dunkelbraun), daher sollten wir verdünnen diese Proben unter Verwendung von THF vor der GC-MS Messung ^6.
4. Analysieren Sie die Proben durch GC-MS (mit einem 1:5 oder 1:10 Split-Verhältnis, Injektionsvolumen = 1 ul, Trägergas Helium = 1,2 mL / min). Verwenden Sie die folgenden GC Temperaturprogramm: Halten bei 150 ° C für 2 Minuten, erhöhen bei 3 ° C pro min auf 280 ° C, erhöht bei 20 ° C pro min auf 300 ° C und dann 5 Minuten lang zu halten. Solvent Delay kann als ~ 5 min (bei einem 30-Meter-GC-Säule) eingestellt werden. Die Reichweite der Masse-Verhältnis (m / z) in MS Ladung kann zwischen 60 und 500 eingestellt werden.

4. GC-MS-Daten-Analyse

1. TBDMS derivatisierten Aminosäure Messung kann auch durch Isotopen-Diskriminierung in GC-Trennung betroffen sein. Leichte Isotope bewegen etwas schneller als hieven Isotope in GC-Säule. Zur Reduzierung der potentiellen Messfehlern, können wir durchschnittlich Massenspektrum des gesamtenAminosäure Peak-Bereich ⁶
2. Die GC-und MS-Spektren von TBDMS derivatisierten Metaboliten vor ⁷ berichtet. Die GC-Retentionszeit und die einzigartige m / z Peaks für jede Aminosäure sind in Abbildung 3 dargestellt.
3. Derivatisierung von Aminosäuren oder zentralen Metaboliten führt erhebliche Mengen von natürlich-markierten Isotope, darunter ¹³ C (1,13%), ¹⁸ O (0,20%), ²⁹ Si (4,70%) und ³⁰ Si (3,09%). Das Messrauschen aus natürlichen Isotope in der Rohmasse Isotopomer Spektrum kann durch die Verwendung veröffentlichte Software ^{5, 8} korrigiert werden. Die endgültige Isotopenmarkierung Daten sind als Massenanteile, z. B. M _0, M _1, M _2, M ₃ und M ₄ gemeldet (die Fragmente mit null bis vier ¹³ C markierten C-Atome).
4. 2-oxo-Glutaraldehyd: Messung von Aminosäuren kann Isotopenmarkierung Informationen rund acht entscheidende Vorstufe Metaboliten bietenaß, 3-P-Glycerat, Acetyl-CoA, Erythrose-4-P, Oxalacetat, Phosphoenolpyruvat, Pyruvat und Ribose-5-P. Die Kennzeichnung Muster in diesen Metaboliten genutzt, um mehrere zentrale Stoffwechselwege (Abbildung 2) ⁹ zu identifizieren. Das Ergebnis der Kennzeichnung Experimente können weiter bestätigt werden durch andere biochemische Methoden (z. B. RT-PCR).

5. Pathway-Analyse unter Verwendung von markierten Aminosäure Daten

Durch die Untersuchung nur ein paar wichtige Aminosäuren aus gut gestalteten ¹³ C Tracer-Experimenten produziert, können wir einige einzigartige Wege oder Enzymaktivitäten, ohne eine ausgefeilte ¹³ C-Stoffwechselflusses Analyse der gesamten zentralen Stoffwechsel zu offenbaren.

1. Entner-Doudoroff Weg: [1 bis ¹³ C] Glucose als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Wenn der Pfad aktiv ist, wird Serin Kennzeichnung deutlich geringer ausfallen als Kennzeichnung in Alanin ^10.
2. Verzweigte TCA-Zyklus: [1 bis ¹³ C]Pyruvat kann als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Wenn der TCA-Zyklus unterbrochen ist, kann Aspartat durch zwei Kohlenstoffatome bezeichnet werden, während Glutamat mit nur einer Kohlenstoff ^{11, 12} gekennzeichnet ist.
3. CO _2-Fixierung von Calvin-Benson-Zyklus in einem Bassham mixotrophen Stoffwechsel: Non-markiertem CO ₂ und beschriftet Kohlenstoffsubstrate sind sowohl als Kohlenstoff-Quellen verwendet. Wenn Calvin-Zyklus funktioniert, wird Serin und Histidin Kennzeichnung deutlich verdünnt werden, im Vergleich zu anderen Aminosäuren. Ein solches Verfahren kann die relative CO _2-Fixierung, wenn organische Kohlenstoffquellen im Medium ¹³ sind.
4. Oxidativer Pentosephosphatweges: [1 bis ¹³ C] Glucose als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Wenn der Pfad aktiv ist, wird nicht-markierten Alanin> 50% ¹² sein.
5. Anaplerotische Weg (zB PEP + CO ₂ à Oxalacetat): ¹³ CO ₂ und nicht-markierten Kohlenstoff Substrate (z. B. Glycerin oder pyruvate) kann als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Wenn der Pfad aktiv ist, wird Aspartat Kennzeichnung deutlich angereichert, im Vergleich zu Alanin und Serin ^13.
6. Re-Citrat-Synthase: [1 bis ¹³ C] Pyruvat kann als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Ist das Enzym aktiv ist, wird Glutamat in β-Carboxylgruppe ^{3, 4} gekennzeichnet.
7. Citramalate Weg: [1 bis ¹³ C] Pyruvat, [2 bis ¹³ C] Glycerin, oder [1 bis ¹³ C] Acetat als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Wenn der Pfad aktiv ist, sind Leucin und Isoleucin Kennzeichnung Mengen identisch ^14.
8. Serin-Isocitratlyase Zyklus: [1 bis ¹³ C] Pyruvat oder [1 bis ¹³ C] Laktat kann als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Wenn der Pfad aktiv ist, wird die dritte Position Kohlenstoff in Serin ¹⁵ zu kennzeichnen.
9. Verwertung der Nährstoffe (dh exogene Aminosäuren): ein Kulturmedium mit vollständig beschriftet Kohlenstoffsubstrate und nicht-markierten Aminosäurenverwendet werden kann. Wenn die Zellen selektiv diese ergänzt nicht-markierten Nährstoffen zu nutzen, werden wir sehen deutliche Kennzeichnung Verdünnung dieser Aminosäuren in der Biomasse. Diese Methode kann verwendet werden, um zu untersuchen, welche Nahrungsergänzungsmittel von der Zelle ¹⁶ sind bevorzugt werden.

6. Repräsentative Ergebnisse

Aktuelle Studien haben Bioenergie Interessen bei der Nutzung neuartiger phototrophen Mikroorganismen für die Erzeugung von Bioenergie wiederbelebt und CO _{2-Abscheidung.} In den letzten Jahren haben etliche 13C-Stoffwechsel-Analysen, einschließlich der erweiterten 13C-Metabolic Flux Analysen (13C-MFA), angewendet worden, um zentrale Stoffwechsel in phototrophen Bakterien zu untersuchen, weil biochemische Kenntnisse der zentralen Stoffwechselwege ist nicht begründet in diesen nicht-Modellorganismen ^{10, 11, 17-20.} Hier präsentieren wir ein Beispiel für die Entdeckung eines alternativen Isoleucin Weg in Cyanothece 51142 ^21. Cyanothece 51142 enthält nicht die Enzym (EC 4.3.1.19, Threonin-Ammoniak-Lyase), die Umwandlung von Threonin katalysiert 2-Ketobutyrat in den typischen Isoleucin Syntheseweg. Zur Behebung des Isoleucin-Weg, wachsen wir Cyanothece 51142 (20 mL) in ASP2 Medium ²² mit 54 mM Glycerin (2-13C,> 98%). Cyanothece 51142 nutzt ^2. Position gekennzeichnet Glycerin als Haupt-C-Quelle. Wir beobachten, dass Threonin und Alanin haben ein Kohlenstoffatom markiert, während Isoleucin mit drei Kohlenstoffatomen gekennzeichnet ist. Deshalb kann die Synthese in Cyanothece 51142 nicht aus dem Threonin Route von den meisten Organismen (Abbildung 4) beschäftigt abgeleitet werden. Auf der anderen Seite haben Leucin und Isoleucin identisch Kennzeichnung Muster auf Fragments (M-15) ⁺ und Fragment (M-159) ^+. Zum Beispiel die Isotopomer Daten aus [M-15] ⁺ (mit unfragmentierte Aminosäuren) zeigen identische Kennzeichnung für Leucin (M0 = 0,01, M1 = 0,03, M2 = 0,21, M3 = 00,69) und Isoleucin (M0 = 0,01, M1 = 0,03, M2 = 0,24, M3 = 0,67). So Leucin und Isoleucin müssen aus dem gleichen Vorläufer (dh, Pyruvat und Acetyl-CoA) synthetisiert werden. Diese Beobachtung steht im Einklang mit den markierten Kohlenstoff Übergang in die citramalate Weg für Isoleucin-Synthese. Um dies zu bestätigen Weg, suchen wir das Joint Genome Institute Datenbank und finden Sie die Anwesenheit eines citramalate Synthase Cima (cce_0248) in Cyanothece.

Abbildung 1. Die ¹³ C-assisted Pathway-Analyse vor.

Abbildung 2. Aminosäuren für den Erwerb der Kennzeichnung Muster ihrer metabolischen Vorstufen verwendet. ACoA, Acetyl-CoA, AKG, α-Ketoglutarat; C5P, Ribose-5-Phosphat; CIT, Citrat, E4P, Erythrose-4-Phosphat; G6P, Glucose-6-Phosphat; OAA, Oxalacetat, PEP, Phosphoenolpyruvat, PGA, 3-Phosphoglycerat; PYR, Pyruvat.

Abbildung 3. GC-Peaks für 16 Aminosäuren. TBDMS derivatisierten Aminosäuren werden durch MS in zwei Fragmente geknackt: (M-57) ^+, welches den gesamten Aminosäure und (M-159) ^+, die nicht über die α Carboxylgruppe der Aminosäure. Für Leucin und Isoleucin, die (M-57) + wurde von anderen Massenpeaks überschnitten. Wir empfehlen die Verwendung Fragment (M-15) + den gesamten Aminosäure Kennzeichnung zu analysieren. Die (F302) + Gruppe ist in den meisten Aminosäuren entdeckt, die nur die erste (α-Carboxylgruppe) und dem zweiten Kohlen in eine Aminosäure-Backbone. Da dieses MS Gipfel hat oft hohe Rausch-Signal-Verhältnis, (F302) ⁺ ist nicht für die quantitative Analyse der metabolischen Flüsse ⁷ empfohlen.

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Abbildung 4. Labeling Übergänge in Isoleucin Wege in Cyanothece 51142 (modifiziert nach unseren bisherigen Papier) ^21.

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Diskussion

Das Protokoll besteht aus Fütterung der Zelle mit einem markierten Substrat und Messung der daraus resultierenden Isotopenmarkierung Muster in den Aminosäuren via GC-MS. Da MS-Daten (m / z-Verhältnisse) nur der Gesamtbetrag der Kennzeichnung von MS-Ionen geben, haben wir auf die Isotopomer Ausschüttungen von Aminosäuren durch die Untersuchung der m / z-Verhältnisse der beiden unfragmentierte (M-57) ⁺ und fragmentiert Aminosäuren zu bewerten (dh, (M-159) ⁺ und (F302) ^+). Darüber h...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
TBDMS	Sigma-Aldrich	19915	-
THF	Sigma-Aldrich	34865	-
Labeled Kohlenstoffsubstrat	Cambridge Isotope Laboratories	Verlassen Sie sich auf die experimentelle Bedingung	Website: http://www.isotope.com
Gas-Chromatographen	Agilent Technologies	Hewlett-Packard, Modell 7890A	-
GC-Säulen	J & W Scientific, Folsom, CA	DB5 (30m)	-
Massenspektrometer	Agilent Technologies	5975	-
Reacti-Vap Evaporator	Thermo Scientific	TS-18825	Zum Trocknen Aminosäure-Proben