Confirmación vía metabólica y el descubrimiento a través de 13 C-etiquetado de proteinogenic Aminoácidos

Resumen

¹³ C-etiquetado de isótopos es una técnica útil para determinar el metabolismo de la célula central para varios tipos de microorganismos. Después las células han sido cultivadas con un sustrato marcado, GC-MS medición puede revelar las vías metabólicas funcional basada en los patrones de etiquetado único en proteinogenic aminoácidos.

Resumen

Los microbios tienen complejos procesos metabólicos que pueden ser investigados con métodos genómica bioquímica y funcional. Una técnica importante para examinar el metabolismo celular central y descubrir nuevas enzimas es de ¹³ C con ayuda de análisis de metabolismo 1. Esta técnica se basa en el etiquetado isotópico, en el que los microbios se alimentan con un ¹³ sustratos C etiquetados. Al trazar las rutas de transición entre el átomo de metabolitos en la red bioquímica, podemos determinar las vías funcionales y descubrir nuevas enzimas.

Como un método complementario a la transcriptómica y proteómica, los enfoques de isotopomer análisis asistido de las vías metabólicas contiene tres pasos principales ^2. En primer lugar, crecen las células con ¹³ substratos C etiquetados. En este paso, la composición del medio y la selección de sustratos marcados son dos factores clave. Para evitar los ruidos de medición de carbono no llevan la etiqueta en los suplementos nutricionales, Un medio mínimo con una única fuente de carbono es necesario. Además, la elección de un sustrato marcado se basa en la eficacia con que aclarará el camino que se analiza. Debido a nuevas enzimas a menudo implican estereoquímica reacción diferente o productos intermedios, en general, solo etiquetados sustratos de carbono son más informativos para la detección de nuevas vías que los etiquetados de manera uniforme para la detección de ^tres nuevas ^{vías, 4.} En segundo lugar, se analizan los patrones de amino ácido etiquetado con GC -MS. Los aminoácidos son abundantes en proteínas y por lo tanto se puede obtener a partir de la hidrólisis de la biomasa. Los aminoácidos pueden ser derivado de N-(terc-butildimetilsilil)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) antes de la separación GC. TBDMS aminoácidos derivado puede ser fragmentado por los Estados miembros y dar lugar a matrices diferentes de fragmentos. Sobre la base de la masa de carga (m / z) La proporción de aminoácidos fragmentados y no fragmentados, podemos deducir los posibles patrones de los metabolitos de la etiqueta central que seprecursores de los aminoácidos. En tercer lugar, se traza la transición 13C de carbono en las vías propuestas y, en base a los datos isotopomer, confirme si estas vías están activas ^2. La medición de aminoácidos proporciona información sobre el etiquetado isotópico ocho metabolitos precursores crucial en el metabolismo central. Estos nodos clave del metabolismo pueden reflejar las funciones de los asociados vías centrales.

¹³ C-análisis asistido por el metabolismo de los aminoácidos a través de proteinogenic puede ser ampliamente utilizado para la caracterización funcional del metabolismo microbiano caracterizado mal ^1. En este protocolo, vamos a utilizar Cyanothece 51142 como la cepa modelo para demostrar el uso de sustratos de carbono marcado por el descubrimiento de nuevas funciones enzimáticas.

Protocolo

1. De cultivo de células (Figura 1)

1. Se cultivan las células en medio mínimo con los elementos traza, sales, vitaminas, y específicamente etiquetados sustratos de carbono que son los mejores para la investigación de la vía. Utilizar cualquiera de frascos de agitación o bioreactores para el cultivo celular. Los nutrientes orgánicos, tales como extracto de levadura, puede interferir con la medición de etiquetado de aminoácidos y por lo tanto no pueden estar presentes en el medio de cultivo.
2. Controlar el crecimiento celular por la densidad óptica de la cultura en una longitud de onda óptima (por ejemplo, OD ₇₃₀ para Cyanothece 51.142) con un espectrofotómetro UV / Vis.
3. Las primeras células pueden ser cultivadas en un medio no-etiquetado. El crecimiento de las células en fase de registro medio se prefiere que se utiliza para la inoculación (3% (v / v) por la relación de volumen de inoculación) del medio de la etiqueta. La cultura de la etiqueta deben ser sub-cultivados (3% v / v relación de inoculación) en el mismo medio la etiqueta para evitar la introducción de la etiqueta de carbono del inóculo inicial.

2. Extracción de aminoácidos

1. Cosecha sub-cultivos de células (10 ml) en la fase de crecimiento media sesión por centrifugación (10 min, 8000 × g).
2. Resuspender el precipitado en 1,5 ml de HCl 6M y transferirlo a un vidrio transparente, con tapa de rosca vial GC. Cap de los viales y colóquelos en un horno de 100 ° C durante 24 horas para hidrolizar las proteínas de la biomasa en los aminoácidos. La hidrólisis de pellets de biomasa puede producir 16 de los 20 aminoácidos comunes (Figura 2) ^5. Cisteína y triptófano se degrada, y la glutamina y asparagina se convierten en el glutamato y el aspartato, respectivamente.
3. Centrifugar la solución de aminoácidos a 20000 × g durante 5 minutos con 2 ml tubos Eppendorf, y la transferencia de los sobrenadantes a los nuevos viales de GC. Este paso elimina las partículas sólidas en la solución de hidrólisis.
4. Quitar las tapas vial GC y secar las muestras completamente bajo una corriente de aire con un Thermo Scientific Reacti-Vap evaporador (nota: un secador de congelación también se puede utilizar to seca las muestras). Este paso se puede hacer durante la noche.

3. Derivatización de aminoácidos y las condiciones de GC-MS

Análisis de aminoácidos o carga / alta de metabolitos polares a través de GC requiere que estos metabolitos se derivatizado, a fin de que los aminoácidos son volátiles y se pueden separar por cromatografía de gases ^2.

1. Disuelva las muestras secas con 150 l de tetrahidrofurano (THF) y 150 l de N-(terc-butildimetilsilil)-N-methyltrifluoroacetamide reactivo de derivatización.
2. Incubar todas las muestras en un horno o un baño de agua entre 65 y 80 ° C durante 1 hora. Vortex ocasionalmente para asegurarse de que los metabolitos en el vial se disuelven.
3. Centrifugar las muestras a 20000 × g durante 10 minutos, y luego transferir el sobrenadante a los nuevos viales de GC. El sobrenadante debe ser una solución clara y amarillenta. Debido a la saturación de los detectores, GC-MS precisión de la medición puede verse afectada por la alta concentration de inyección TBDMS derivado de aminoácidos (las muestras a menudo muestra de color marrón oscuro), por lo tanto, hay que diluir las muestras con THF antes de GC-MS medición ^6.
4. Analizar las muestras por GC-MS (usar un split 1:5 o 1:10, el volumen de inyección = 1 l, de transporte de gas helio = 1,2 ml / min). Utilice el siguiente programa de GC temperatura: mantener a 150 º C durante 2 minutos, el aumento de 3 ° C por minuto hasta 280 ° C, aumentando a 20 ° C por minuto hasta 300 ° C y mantenga durante 5 minutos. Espera para el solvente se puede establecer como ~ 5 minutos (para una columna de 30 metros GC). El rango de la masa de carga (m / z) en la EM se puede establecer entre 60 y 500.

4. GC-MS análisis de datos

1. TBDMS derivado de medición de aminoácidos también pueden verse afectados por la discriminación de isótopos en la separación de GC. Isótopos ligeros se mueven ligeramente más rápido que levantar los isótopos en la columna GC. Para reducir el potencial de sesgo de medición, es posible que la media del espectro de masas de todo elaminoácido rango máximo ⁶
2. La GC y los espectros de MS de metabolitos TBDMS derivado se ha informado antes de las ^7. El tiempo de retención GC y los picos únicos m / z para cada aminoácido se ilustra en la Figura 3.
3. Derivatización de aminoácidos o de metabolitos central introduce grandes cantidades de isótopos naturales marcado, entre ellos ¹³ C (1,13%), ¹⁸ S (0,20%), de ^{29 años} Si (4,70%), y ³⁰ Si (3,09%). La medición del ruido de los isótopos naturales en el espectro de masa isotopomer primas pueden ser corregidos mediante el uso de software publicado ^{5, 8.} Los datos finales de etiquetado isotópico se presentan como fracciones de masa, por ejemplo, M _0, M _1, M _2, M ₃ y M ₄ (en representación de los fragmentos que contienen cero a cuatro átomos de carbono marcados ¹³ C).
4. La medición de los aminoácidos pueden proporcionar información sobre el etiquetado isotópico ocho metabolitos precursores crucial: 2-oxo-glutarcomió, 3-P-glicerato, acetil-CoA, eritrosa-4-P, oxalacetato, fosfoenolpiruvato, piruvato y la ribosa-5-P. Los patrones de etiquetado de estos metabolitos pueden ser utilizados para identificar varias rutas metabólicas centrales (Figura 2) ^9. El resultado de los experimentos de etiquetado puede ser confirmado mediante otros métodos bioquímicos (por ejemplo, RT-PCR).

5. Vía de análisis utilizando datos de la etiqueta de aminoácidos

Al investigar sólo algunos ácidos clave amino producidos a partir de experimentos bien diseñados ¹³ C del marcador, que puede revelar varias vías únicas o las actividades de la enzima sin necesidad de realizar sofisticados ¹³ C-metabólico análisis de flujo del metabolismo central de todo.

1. Entner-Doudoroff vía: [1 - ¹³ C] glucosa puede ser utilizada como fuente de carbono. Si la vía está activa, el etiquetado serina será significativamente menor que el etiquetado de la alanina ^10.
2. Ciclo ramificada TCA: [1 - ¹³ C]piruvato puede ser utilizado como fuente de carbono. Si el ciclo de TCA se ha roto, aspartato pueden ser etiquetados por dos átomos de carbono, mientras que el glutamato es etiquetado con sólo un átomo de carbono ^{11, 12.}
3. Fijación de CO ₂ por Calvin-Benson-Bassham ciclo en el metabolismo mixotróficos: no marcado y etiquetado de CO ₂ sustratos de carbono son utilizados como fuentes de carbono. Si el ciclo de Calvin es funcional, serina y etiquetado histidina será significativamente diluida, en comparación con otros aminoácidos. Tal método puede determinar la relación CO ₂ cuando la fijación de fuentes orgánicas de carbono están presentes en el medio ^13.
4. Vía oxidativa de las pentosas fosfato: [1 - ¹³ C] glucosa puede ser utilizada como fuente de carbono. Si la vía está activa, la alanina sin etiqueta será> 50% ^12.
5. Anapleróticas vía (por ejemplo, PEP + CO ₂ oxalacetato a): ¹³ CO ₂ y no de carbono marcado sustratos (por ejemplo, el glicerol o pyruvate) se puede utilizar como fuente de carbono. Si la vía está activa, el etiquetado aspartato se ha enriquecido considerablemente, en comparación con alanina y serina ^13.
6. Re-citrato sintasa: [1 - ¹³ C] piruvato puede ser utilizado como fuente de carbono. Si la enzima está activa, el glutamato es etiquetada en β-carboxilo grupo de ^{3, 4.}
7. Vía Citramalate: [1 - ¹³ C] piruvato, [2 - ¹³ C] glicerol, o [1 - ¹³ C] acetato se puede utilizar como fuente de carbono. Si la vía está activo, las cantidades de etiquetado leucina e isoleucina son idénticos ^14.
8. Serina-isocitrato liasa ciclo: [1 - ¹³ C] piruvato o [1 - ¹³ C] lactato puede ser utilizado como fuente de carbono. Si la vía está activa, la tercera posición de carbono en la serina se etiquetarán ^15.
9. Utilización de los nutrientes (es decir, aminoácidos exógenos): un medio de cultivo con sustratos de carbono completamente etiquetados y no etiquetados aminoácidosse puede utilizar. Si las células de forma selectiva utilizar estos nutrientes complementa los no etiquetados, vamos a ver una dilución significativa de etiquetado de estos aminoácidos en la biomasa. Este método puede ser utilizado para investigar lo que los suplementos de nutrientes son los preferidos por la celda ^16.

6. Resultados representante

Estudios recientes han reavivado el interés de bioenergía en el uso de nuevos microorganismos fototróficas para la producción de bioenergía y la captura de CO _2. En los últimos años, un buen número de metabolismo de la 13C-análisis, incluyendo avanzados análisis de flujo metabólico-13C (13C-AMF), se han aplicado para investigar el metabolismo central en bacterias fototróficas, porque el conocimiento bioquímico de las rutas metabólicas centrales no está bien fundada en estos organismos que no son modelo ^{10, 11, 17-20.} Aquí, se presenta un ejemplo del descubrimiento de una vía alternativa en isoleucina Cyanothece 51.142 ^21. Cianothece 51.142 no contiene la enzima (EC 4.3.1.19, treonina amonio-liasa), que cataliza la conversión de treonina a 2-cetobutirato en la vía de síntesis de isoleucina típico. Para resolver la vía isoleucina, crecemos Cyanothece 51.142 (20 ml) en medio ASP2 ²² con glicerol de 54 mm (2-13C,> 98%). Cyanothece 51142 utiliza 2 ^ª posición de glicerol etiquetados como fuente de carbono principal. Observamos que la treonina y alanina tienen una etiqueta de carbono, mientras que la isoleucina es etiquetado con tres carbonos. Por lo tanto, la síntesis de Cyanothece 51142 no se puede derivar de la ruta treonina empleado por la mayoría de los organismos (Figura 4). Por otro lado, leucina e isoleucina tienen patrones idénticos de etiquetado basado en fragmentos (M-15) y el fragmento ⁺ (M-159) ^+. Por ejemplo, los datos isotopomer de [M-15] ⁺ (que contiene los aminoácidos no fragmentado) muestran el etiquetado idénticas de leucina (M0 = 0,01, M1 = 0,03, M2 = 0.21, M3 = 00.69) e isoleucina (M0 = 0,01, M1 = 0,03, M2 = 0.24, M3 = 0,67). Así, leucina e isoleucina se sintetiza a partir de los precursores del mismo (es decir, el piruvato y el acetil-CoA). Esta observación es consistente con la transición de carbono marcado en la vía citramalate para la síntesis de isoleucina. Para confirmar esta vía, que buscar en la base de datos Joint Genome Institute y encontrar la presencia de una sintasa citramalate Cima (cce_0248) en Cyanothece.

Figura 1. El ¹³ C con ayuda de los pasos de análisis vía.

Figura 2. Los aminoácidos utilizados para la adquisición del patrón de etiquetado de sus precursores metabólicos. ACOA, la acetil-CoA, AKG, α-cetoglutarato; C5P, ribosa 5-fosfato, CIT, citrato; E4P, eritrosa 4-fosfato, G6P, glucosa 6-fosfato, OAA, oxalacetato, PEP, fosfoenolpiruvato, PGA, 3-fosfoglicerato, PYR, el piruvato.

Figura 3. Picos GC de 16 aminoácidos. TBDMS aminoácidos derivatizados están agrietadas por los Estados miembros en dos fragmentos: (M-57) ^+, que contiene el ácido amino todo, y (M-159) ^+, que carece del grupo α carboxilo del aminoácido. De leucina e isoleucina, el + (M-57) fue solapado por los picos de masas. Sugerimos el uso de fragmentos (M-15) + para analizar el etiquetado completo de aminoácidos. El grupo (F302) + se detecta en la mayoría de los aminoácidos, que contiene sólo el primero (α-carboxilo del grupo) y los carbones segundo en una red troncal de aminoácidos. Debido a que este pico de MS a menudo ha de ruido a la señal de ratios, (F302) ⁺ no se recomienda para analizar cuantitativamente los flujos metabólicos ^7.

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Figura 4. Etiquetado de las transiciones en las vías de isoleucina en Cyanothece 51.142 (modificado a partir de nuestro trabajo anterior) ^21.

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Discusión

Este protocolo consiste en alimentar la celda con un sustrato marcado y medición de los patrones resultantes isotópica de etiquetado en los aminoácidos a través de GC-MS. Desde MS de datos (m / z ratios) dar la cantidad total de etiquetado de los iones de MS, tenemos que evaluar las distribuciones de isotopomer de aminoácidos mediante el examen de la m / z ratios de ambos no fragmentado (M-57) ⁺ y fragmentado aminoácidos (es decir, (M-159) y ⁺ (F302) ^+). Además, podemos realizar v...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
TBDMS	Sigma-Aldrich	19915	-
THF	Sigma-Aldrich	34865	-
De carbono marcado sustrato	Cambridge Laboratorios de isótopos	Dependen del requisito experimental	Sitio Web: http://www.isotope.com
Cromatógrafo de gases	Agilent Technologies	Hewlett-Packard, modelo 7890A	-
GC Columnas	J & W Scientific, Folsom, CA	DB5 (30)	-
Espectrómetro de masas	Agilent Technologies	5975C	-
Reactivación-Vap EvaporAtor	Thermo Scientific	TS-18825	Para el secado de las muestras de aminoácidos