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摘要

一个简单的微流体装置已经发展到进行麻醉免费成像 C.线虫完整果蝇

摘要

微机电制流体设备提供一个可访问的微环境中的小型生物体内研究。简单的制造工艺可用于微流体装置使用软光刻技术1-3。亚细胞成像4,5，微流体器件已被用于在体内激光显微2,6和细胞成像4,7 在体内成像需要固定的生物体。取得这样的成绩使用吸力5,8，锥形通道6,7,9，变形膜2-4,10，吸气额外的冷却5，麻醉气体，温度敏感凝胶12，氰基丙烯酸酯胶13和麻醉剂如左旋咪唑14 ，15。常用麻醉药影响突触传递16,17和是已知的亚细胞神经传输4上有不利影响。在这种ST乌德我们展示了一个基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的装置，可以让完整的遗传模式生物，如线虫线虫 ， 果蝇和斑马鱼幼虫的麻醉剂无固定膜。这些模式生物在体内研究微流体装置，因为他们小的直径和光学透明或半透明的机构适合。体直径范围从〜10微米〜800微米的早期幼虫阶段C.线虫和斑马鱼幼虫和要求的不同尺寸的微流体装置，实现完整的固定的高分辨率时间的推移成像。这些生物体被固定使用施加的压力由压缩氮气通过液体柱和成像使用倒置显微镜。从陷阱释放的动物在10分钟之内返回到正常运动。

我们演示了四个应用程序时移成像C.线虫即，成像线粒体运输中的神经元，突触前囊泡运输中的运输缺陷的突变体，谷氨酸受体运输和Q神经母细胞分裂。从这样的电影中获得的数据，表明微流的固定化是一个有用的和准确的方法，麻醉动物（ 图1J和3C-F 4）相比时， 在体内细胞和亚细胞事件的数据的获取。

设备外形尺寸进行修改，以允许时间推移成像的不同阶段C.的一龄果蝇和斑马鱼幼虫。运输标记GFP（syt.eGFP）在感觉神经元的突触小泡的基本完整的一龄果蝇幼虫表达的胆碱能神经的感觉神经元中的突触囊泡的标记显示定向运动。一个类似的装置已经被用来进行时间推移成像的心跳在受精后30小时（HPF）斑马鱼幼虫。这些数据表明，我们已经开发的简单的设备可以适用于各种各样的模型系统，以研究几个细胞在体内的生物和发育的现象。

研究方案

1。 SU8主制造

  1. 设计的微流体的结构使用Clewin软件和打印它使用65,024 DPI激光绘图仪与最小特征尺寸为8μm的对电路板膜。
  2. 清洁2厘米×2厘米的硅晶片，与在20％的KOH，持续1分钟，并在去离子水中冲洗，每一个晶片的流动层和其相应的控制层的原生氧化层。
  3. 件用氮气吹干，4小时，脱水，在120℃的热板上。允许的作品冷却至室温，然后再进行下一个步骤。
  4. 将硅块在时间上的微调夹头，打开真空。量的硅表面与〜20微升的六甲基二硅氮烷（HMDS）和涂层使用SPIN150喷丝在500rpm下5秒，持续30秒，然后3,000 rpm下。
  5. 完全覆盖硅晶片〜1.5毫升SU8-2025（ 包含http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm）和大衣晶片使用SPIN150喷丝在500rpm下，持续5秒，30秒，然后2,000 rpm转速。该纺丝的协议产生〜40微米的光致抗蚀剂的厚度是适合的C.早期幼虫阶段的控制和流量层线虫 。
  6. 自旋〜1.5毫升的SU8-2050使用SPIN150喷丝在500rpm下5秒，然后2,000 rpm转速，持续30秒，得到的光致抗蚀剂的厚度约为80微米，后期幼体阶段C 的适合用于流层制造线虫 ， 果蝇 /斑马鱼幼虫及其相应的控制层的基流层。
  7. 放置在硅基片上热板与SU8涂布层的顶部上。软烘烤涂覆的硅片在65℃下进行1分钟，然后95℃10分钟。允许的作品冷却至室温，然后再进行下一个步骤。
  8. 将曝光舞台上SU8-2025涂层表面的软出炉的硅块面对面临的UV灯的顶部。流层和控制层模式使用的光掩膜设计I（L1， 图1B）和设计（二）（L2， 图1B）分别为早期幼虫阶段C.线虫 。 SU8层的顶部上，并放置在光掩模，确保掩模对涂布层是平坦的。打开快门的UV灯和200瓦特的UV灯，持续15秒，通过光掩模暴露软烘烤SU8晶片。
  9. 使用的光掩膜设计I（L1， 图1B）和设计（二）（L2， 图1B）上涂SU8-2050件（准备步骤1.6）制作的流程层和控制层C.为后期幼体阶段线虫 。使用的光掩膜的设计I（L1， 图1C）和设计（二）（L2， 图1C）为基础的流层和控制层分别为果蝇 /斑马鱼幼虫的晶圆上涂SU8-2050（准备我n步1.6）。揭露SU8表面，通过光掩模，以200瓦，持续15秒的UV灯。
  10. 将暴露的硅片与涂覆层的顶部上的热板上。发布为1分钟，然后95℃下10分钟，在65℃下烘烤晶片。允许件冷却下来，然后再进行下一个步骤。
  11. 开发件使用的SU8显影剂溶液20分钟。清洗件在异丙醇（IPA），并用氮气吹干气体。
  12. 放置在干燥器中的硅片与的SU8图案上顶部。大衣件tricholoro（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷2小时，在干燥器中的蒸气用50μl。

注意事项：在KOH治疗期间，光阻涂布和发展，采取安全预防措施，对化学品的处理。硅烷的蒸气涂料应在通风良好的地方干燥器内进行。保护SU8抵制过度暴露在光线下。使用防护眼镜UV韧带羟色胺的来源。

2。 PDMS模具制造

  1. 准备10:1 PDMS通过组合用5克在塑料杯中的固化剂50克Sylgard的184碱。手动混合的内容〜3分钟。德加的干燥器内，以除去所有的气泡混合过程中形成的混合物。
  2. 以上的硅晶片用SU8图案设计II，倒入5毫米厚的聚二甲基硅氧烷的混合物，用于控制层，轻轻地避免形成气泡。如果气泡形成过程中浇注，脱气PDMS SU8在低真空模式，以除去所有的气泡。
  3. SU8-2025模式的设计，我将在硅片，流层，微调夹头和，打开真空保持。量晶片以〜1毫升的PDMS混合物和涂覆的晶片使用在500rpm喷丝SPIN150 5秒后跟1,500 rpm下，持续30秒。
  4. 大衣〜1毫升PDMS与80微米的SU8-2050设计I（L1， 图1B）的图案，对于硅晶片上的混合流层C.为后期幼体阶段线虫使用SPIN150喷丝在500rpm下，持续5秒，随后以1000rpm，持续30秒。涂上一层厚厚的聚二甲基硅氧烷混合硅块SU8-2050的流层设计I（L1， 图1C）， 果蝇 /斑马鱼幼虫的模式，在500转每分钟为35秒SPIN150微调。
  5. 烘烤PDMS涂硅块的设计和相应的设计（二）控制层的晶圆含有PDMS为C.线虫和/或果蝇 /斑马鱼幼虫在热空气对流烘箱中在50℃下进行6小时。
  6. 切出含有SU8图案II 用于 C从硅衬底的PDMS片线虫和/或果蝇 /斑马鱼幼虫用锋利的刀片。 〜1毫米直径的储层的顶部连接的主要陷阱在PDMS模具使用哈里斯打孔器打一个小孔。
  7. 将打孔PDMS块（含40微米厚的模具控制层L2）上的塑料托盘，与成型体的控制层侧的面朝上。将PDMS涂层的硅晶片载有40微米厚的SU8的设计，我在同一个托盘，PDMS涂层表面朝上。插入托盘等离子体清洁器腔室的内部，开启真空，持续2分钟。随后，打开等离子电源，降低腔室压力，直到将光粉红色。两个表面暴露至18瓦特空气等离子体，在低真空下，持续2分钟。
  8. C.为后期幼体阶段，将打孔的PDMS块从80微米厚的含SU8主模式II 线虫或果蝇 /斑马鱼幼虫上的塑料托盘，与成型体的控制层侧的面朝上。将相应的焙烤PDMS层旋涂在硅晶片上，含有80微米厚的设计，我购买C.线虫阶段或果蝇的 /斑马鱼幼虫同时在同一托盘上的平板PDMS涂层的小号urface朝上。上述使用相同的协议，将其暴露在空气等离子切割。
  9. 将两个等离子体处理后的表面为C.线虫和/或果蝇 /斑马鱼幼虫连同温和的压力和烘烤它们在热空气对流烘箱中在50℃下2小时。
  10. 切出的硅衬底C. SU8的设计，我为保税设备线虫和/或果蝇 /斑马鱼幼虫。打孔水库的流路的入口和出口的通道孔。
  11. 将保税PDMS模具在塑料托盘C.线虫 ，与模制侧的面朝上的流动层设计。清洁玻璃盖片（22 X 22毫米，厚度1号），并把它放在同样的塑料托盘。将PDMS模具和玻璃盖片的等离子腔体内部装有。公开的底部的PDMS表面的装置和盖玻片至18瓦特空气等离子在低的压力，持续2分钟。将两个等离子体处理的表面，与根幔压力和烤它们在热空气对流烘箱中在50℃下2小时。
  12. 将装置存放在一个清洁的环境，以备将来使用。

3。其他果蝇的 /斑马设备的步骤

  1. 公开清洁的玻璃表面的尺寸，2厘米×2厘米用tricholoro50μl的（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷2小时，在干燥器中的蒸气。
  2. 自旋〜1毫升在步骤2.1制备使用SPIN150喷丝在500rpm，35秒的硅烷化的玻璃表面上的10:1的PDMS组合。烘烤的PDMS涂覆的玻璃基板在热空气烘箱中，在50℃6小时，与涂覆的表面朝上。允许PDMS层冷却至室温，然后再进行下一个步骤。
  3. 打孔机使用一个定制的尖锐的金属打孔器的PDMS的中间，以形成隔离物的PDMS层的涂敷层。类似果蝇 /斑马鱼（L1， 图1C中的流程设计的形状设计的金属打孔器）。
  4. 公开的PDMS间隔层和单键合的嵌段（流动层和控制层， 果蝇 /斑马鱼幼虫在步骤2.9）至18瓦特空气等离子体，使用在低真空度的等离子体清洁器。一起放置两个等离子体处理的表面，他们在一个热空气烘箱中于50℃下2小时和烘烤。
  5. 从玻璃剪切键合设备，冲头进入孔的入口和出口的水库和债券使用的等离子体清洁器，提到在步骤2.11，玻璃盖片（22×22毫米，厚度1号）。这将产生一个固定装置为一龄果蝇幼虫〜500微米的通道高度。斑马鱼幼虫，重复的的PDMS间隔层制造工艺与一个额外的键合工序。双层的PDMS-S生产900微米的高度为30 HFP斑马鱼幼虫的渠道。

注意事项：避免设备制造过程中的粉尘颗粒。两个等离子清洗的表面的需要是完全无尘适当的结合。存储设备，在干燥器中在一个特殊的洁净室的情况下是不可用的，以尽量减少设备中的灰尘颗粒的积累。

4。使用硅橡胶膜

  1. 通过18号针（外径〜1.25毫米的微柔性管（内径〜1.6毫米，外径为〜4.8毫米）的一端连接到一个加压的氮气气体供给调节器和另一端连接到主陷阱储层）粘到管。 A 3路活塞用于在中间管连接允许应用程序或在膜上的压力释放。
  2. 填充管的PDMS的移动设备连接到蒸馏水中，用10厘米柱，然后再连接到储存器的主要的C.陷阱线虫和/或果蝇 /斑马鱼幼虫的移动设备。
  3. 转动阀的供氮读取14 psi和监察次偏转朝向主陷阱膜Ë流道倒置显微镜在低倍。的水柱在微柔性管的长度的3路活塞打开时，被压缩。偏转膜的边缘是在透射光中（ 图1I和1J）可见。膜偏转导致的PDMS膜下的尘埃颗粒/气泡的位移，并推压它们的信道边界。
  4. 等待，直到填补了微通道液体前，完全没有任何气体。
  5. 释放压力，通过使用的3路活塞放松到其静止位置的膜。

5。插入C.线虫 ， 果蝇和斑马鱼幼虫侵入设备，固定在灵活的PDMS膜

  1. 填充M9的缓冲液的流路与[3克KH 2 PO 4，6克Na 2 HPO 4，5克NaCl，1毫升1M的用MgSO 4，H 2 O至1升，由引渡消毒oclaving] C.线虫 18或1X PBS [8克NaCl，0.2克KCl，1.44克Na 2 HPO 4，0.24克KH 2 PO 4，H 2 O至1 L，灭菌果蝇 /斑马鱼幼虫19之前的10分钟的高压灭菌]实验。
  2. 找到一个单一的C.线虫所需的阶段NGM板18上一个（或一龄果蝇幼虫琼脂鸡蛋板或手动dechorionated的30斑马鱼斑马鱼幼虫在液体培养基中20），使用低倍率体视显微镜。选择一个单一的动物，使用小体积的缓冲溶液成一个微小费。使用微尖，其最终削减，以适应更大的果蝇或斑马鱼幼虫在缓冲。
  3. 推入单一的有机体通过流道的入口处。调整移液压力定位下的动物个体的主要陷阱。
  4. 慢慢地增加压力的PDMS膜定位议员动物对的NEL边界和固定用14 psi的压力C.线虫 ， 果蝇 ，斑马鱼幼虫和3磅7磅。
  5. 固定的动物放置在显微镜的视场的中心。使用倒置显微镜，高分辨率明场或荧光成像所需的设置。获得单或时间推移荧光图像在预定义的帧速率。
  6. 释放陷阱的压力和监管的动物在低放大倍率为5-10分钟的运动。
  7. 冲洗动物，并插入一个新的动物，以重复上述步骤。
  8. 清洗所有的动物从废液池，用蒸馏水采用注射器。干的推动空气通道的使用注射器以备将来使用。

注意事项：动物移液压力要求较高的内流的主要通道从陷阱中释放后，往往表现出的运动/健康欠佳，应避免为IMA晋。清洁的流路的任何痕量的缓冲液，以防止堵塞的通道晶体。如果液压油用于高分辨率成像，清洁玻璃盖片是随后的实验中，能保持良好的信噪比。

结果

固定装置是一个通过粘接两层制成的双层PDMS块：的流动层（第1层）和一个控制层（第2层），如在图1中所示。的主要的陷阱被连接到氮气瓶通过一个调节器和一个三路停止旋塞应用必要的（3-14磅）的压力通过液体柱（ 图1A）到膜上。偏转膜固定C。线虫 ， 果蝇或斑马鱼幼虫在具有不同尺寸（ 图1B和1C）的流动通道设计。 C.不?...

讨论

PDMS微流体装置是光学透明的，因此，可用于任何透明/半透明的模型生物体在体内成像的高分辨率。我们的设计是适合高倍率完整的活的动物细胞和亚细胞事件的时空成像。微细加工用软光刻技术，可轻松操作的模式生物的各种尺寸的设备尺寸。 C.不同阶段制造各种尺寸的移动设备线虫 ， 果蝇和斑马鱼幼虫。移动设备具有不同的高度为40μm和80μm，在其流层通道?...

披露声明

没有利益冲突的声明。

致谢

我们感谢果蝇股，Tarjani阿加瓦尔博士Krishanu雷为保持果蝇笼，彼得·若为nuIs25和CGC为C.的菌株。 SPK取得jsIs609在迈克尔·九重实验室。我们感谢他的帮助下，在微流体装置jsIs609动物的线粒体运输时间的推移成像Arpan Agnihotri（BITS Pilani的）。我们非常感谢博士瓦沙拉Thirumalai和Surya普拉卡什为我们提供了与斑马鱼的胚胎。我们感谢博士奎师那和CIFF NCBS支持部科学和技术中心的纳米技术（第SR/55/NM-36-2005）的旋转盘共聚焦显微镜的使用。我们也感谢Kaustubh劳，V. Venkatraman和雀塔那Sachidanand的进行讨论。这项工作是由DBT博士后研究（SM），DST快车道计划（SM）和DBT授予（SPK）。 SA的支持由DST和CSIR SPK补助金。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
的试剂的名称 公司 目录编号 评论（可选）
硅晶片大学晶圆 150毫米（100）机械级SSP硅
Clewin软件 WieWeb软件版本2.90
激光光绘机精细线成像 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich公司 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025年，SU8-2050
开发人员 Microchem SU8开发
硅烷 Sigma-Aldrich公司 448931-10G
PDMS 道康宁 SYLGARD 184
UV灯奥丽尔 66943 200W汞奥列尔灯
热空气炉中超仪器订制设置在50℃下
热板 IKA实验室设备 3810000 http://www.ika.com
等离子清洗机 Harrick旅游等离子 PDC-32G
微调半导体制造装置 SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
盖玻片金印 22 X 22毫米，第1号的厚度
线虫 秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC） e1265，ayIs4
果蝇 布卢明顿的P {chaGAL4} / CYO，UAS-syt.eGFP
斑马鱼印度野生型野生型
聚乙烯管西格玛 Z279803
微针西格玛 Z118044 切成1厘米的片
3路活塞西格玛 S7521
哈里斯冲床西格玛 Z708631
压缩氮气当地燃气供应商使用的压力调节器来控制
体视显微镜 尼康 SMZ645
共聚焦显微镜安道​​尔与奥林巴斯横河电机的旋转圆盘激光共聚焦显微镜
ImageJ的美国国立卫生研究院 www.rsbweb.nih.gov / IJ 基于Java的图像处理程序

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